МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 516-529
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.[11+92].012.4
ТОНКОЕ СТРОЕНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ КЛЕТОК НЕКОТОРЫХ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
© 2004 г. Н. Е. Сузина*, А. Л. Мулшкин**, А. Н. Козлова**, А. П. Шорохова*, В. В. Дмитриев*, Е. С. Баринова*, О. Н. Мохова***, Г. И. Эль-Регистан**, В. И. Дуда**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино **Институт микробиологии РАН, Москва ***Пущинский государственный университет, Пущино Поступила в редакцию 09.10.03 г.
С помощью электронно-микроскопических методов (ультратонкие срезы, криосколы) изучена тонкая структура покоящихся клеток Micrococcus luteus, Arthrobacter globiformis и Pseudomonas auranti-aca, формирующихся в длительно инкубируемых (до 9 мес.) культурах. Среди покоящихся клеток выявлены цистоподобные формы, характеризующиеся сложной структурой клеток и следующими ультраструктурными особенностями: 1) утолщенной либо многопрофильной клеточной стенкой (КС), представленной у значительной части клеток слоем старой КС и 1-3 муреиновыми слоями КС, синтезированными de novo; 2) толстой структурно дифференцированной капсулой; 3) наличием в цитоплазматической мембране M. luteus и A. globiformis крупных интрамембранных частиц (d = = 180-270 А), выявляющихся как на PF-, так и на EF-поверхностях сколов мембран; 4) мелкогранулярной структурой цитоплазмы - у одной части и комковатой (крупногранулярной) - у другой части клеток; 5) конденсированным нуклеоидом. Интенсивное образование цистоподобных клеток наблюдалось в старых (2-9-месячных) культурах бактерий, выращенных на разбавленных сложных питательных средах, синтетических средах (лимитированных по источникам N, C, и P) и в суспензиях клеток, инкубированных в среде с кремнекислым натрием. Выявленные особенности общей морфологии, ультраструктурной организации и физиологических свойств цистоподобных клеток, формирующихся в цикле развития культур, свидетельствуют о том, что принципиально для неспорооб-разующих бактерий характерен конститутивный покой.
Ключевые слова: цистоподобные клетки, неспорообразующие бактерии, ультраструктура клеток, мембраны, клеточные стенки, покой у микроорганизмов, вечная мерзлота.
Известно, что выживаемость многих бактерий в неблагоприятных условиях внешней среды связана с образованием ими различных типов специализированных структурно сложноорганизованных покоящихся клеток, таких как эндо- и экзоспоры, "конидии", цисты и другие формы. Они образуются в результате клеточной дифференцировки на заключительных стадиях онтогенетического цикла развития культур и отличаются от метаболически активных вегетативных клеток по морфогенезу, ультраструктуре, физиологии и биохимическому составу [1]. В то же время эти специализированные структурно сложные формы покоящихся клеток не обнаружены в лабораторных условиях у представителей многих видов прокариот. В связи с этим некоторые исследователи ставят под сомнение наличие конститутивного покоя у неспо-рообразующих бактерий, так как не обнаруживают у них форм с соответствующим типом обмена [2]. Однако более логично предположить, что у представителей этой группы прокариот функцию, связанную с длительным и сверхдлитель-
ным покоем и переживанием неблагоприятных условий в природе, также выполняют специализированные, но иные по структуре и механизму образования покоящиеся клетки. При этом следует иметь в виду, что лабораторные условия культивирования и искусственные питательные среды не раскрывают весь фенотипический потенциал и разнообразие типов покоящихся клеток, свойственных природным формам микроорганизмов. Так, например, Зекман и Касида [3] получили данные, позволившие им сделать заключение о том, что такие типичные неспорообразующие гра-мотрицательные бактерии, как псевдомонады, в почве формируют устойчивые, длительно сохраняющиеся покоящиеся цистоподобные клетки. В наших исследованиях, посвященных изучению различных форм покоя, было показано, что многие виды микроорганизмов, в том числе неспорообразующие бактерии и дрожжи, образуют цистоподобные клетки с высокой степенью рефрак-терности, обладающие рядом существенных характеристик, свойственных специализированным
покоящимся клеткам [4-6]. Их образование, наряду с другими факторами, контролируется концентрационным уровнем и активностью внеклеточных факторов dx [4, 5], относящихся по химической природе к алкилоксибензолам (АОБ) [7, 8], механизм действия которых рассмотрен в работах [9, 10]. Особенности общей морфологии и тонкой структуры цистоподобных клеток были нами кратко охарактеризованы на примере некоторых видов бактерий [4-6]. Однако не имеется достаточно данных для ответа на такие важные вопросы, как: 1) какова глубина перестроек на ультраструктурном и молекулярном уровнях у ЦПК по сравнению с вегетативными клетками; 2) какова степень внутривидовой гетерогенности структурных типов ЦПК; 3) в чем выражаются сходство и различия в ультраструктурной организации лабораторных и природных форм ЦПК in situ. Вместе с тем, очевидно, что без выяснения принципиальных особенностей структурно-функциональной организации покоящихся клеток невозможно понять причины и механизмы длительного выживания микроорганизмов при неблагоприятных условиях в природе.
В настоящей работе приводятся данные об особенностях ультраструктурной организации цистоподобных клеток Micrococcus luteus, Arthrobacter globiformis и Pseudomonas aurantiaca, получаемых экспериментально в лабораторных условиях в цикле развития их культур, а также покоящихся форм, выделенных из природных грунтов методом низкотемпературного фракционирования.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия их культивирования. Объектами исследований были бактерии с различной структурой их клеточных оболочек: грамположительные - Micrococcus luteus, штамм NCIMB-13267, Arthrobacter globiformis, штамм B-1112 (ВКМ) и грамотрицательные - Psedomo-nas aurantiaca, штамм B-1558 (ВКМ).
Бактерии M. luteus выращивали на синтетической питательной среде, охарактеризованной в работе [5], A. globiformis - на средах, описанных в работе [6], P. aurantiaca - на 50%-ном МПБ, а также на синтетической среде 23А c 0.2% глюкозы [11]. Бактерии инкубировали при 28°С в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на качалке при 140-160 об/мин. В качестве инокулята использовали культуры стационарной фазы роста, выращенные на МПБ. Инокулят вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность суспензии - 0.1 (к = 650 нм, l = 10 мм).
Цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК) бактерий получали: а) в длительно инкубирующихся (2-9 мес.) при комнатной температуре культурах, выращенных на средах с лимитом по
азоту или фосфору (концентрации в 10 раз меньше, чем в стандартной прописи); б) в культурах, инкубировавшихся в течение 2 мес. после внесения в них (в стационарной фазе) 4-н гексилрезор-цина (С6-АОБ, М = 196) до концентраций 10-4-5 х х 10-4 М; в) в суспензиях клеток в 0.09%-ном растворе кремнекислого натрия (рН 7.4), инкубировавшихся при комнатной температуре в течение 3 мес. В последней серии опытов использовали культуры: 1) экспоненциально растущие (6 ч); 2) стационарные (3 сут); 3) длительно хранящиеся (3-5 мес.) культуры, выращенные на среде с лимитом по азоту. Клетки в вышеперечисленных вариантах осаждали центрифугированием (4000 g), ресуспендировали в 2 мл стерильного раствора кремнекислого натрия и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 мес.
О количестве жизнеспособных клеток судили по числу колониеобразующих единиц (КОЕ), учитываемых при высеве клеточных суспензий на МПА.
Получение фракций клеток из природных субстратов. Микроорганизмы из грунтов и почв сепарировали с помощью разработанного нами метода низкотемпературного фракционирования клеток [12]. В качестве субстратов для выделения клеток микроорганизмов использовали грунты и почву вечной мерзлоты Восточной Сибири (Колыма) и грунты нефтешламов, хранившиеся в шламона-копителях Нижнекамского нефтекомбината в течение 10 лет. Использованные грунты вечной мерзлоты, взятые с глубины ~60 м, имели возраст 1-3 млн. лет; их характеристика приведена в работе [13].
Светомикроскопические наблюдения проводили с помощью микроскопов АшрНуа1 (ГДР) и МБИ-15, снабженных фазово-контрастными устройствами.
Электронно-микроскопические методы исследования. Ультратонкие срезы. Осадок клеток микроорганизмов после центрифугирования фиксировали в 1.5%-ном растворе глютарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч; трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1%-ном растворе 0з04 в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течении 3 ч при 20°С. После обезвоживания материал заключали в эпоксидную смолу Ероп 812. Ультратонкие срезы контрастировали в течение 30 мин в 3%-ном растворе уранилацетата в 70%-ном спирте и дополнительно окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу при 20°С в течение 4-5 мин.
Криосколы клеток получали в вакуумной установке ХЕЕ-4Х (1Е0Ь, Япония) с помощью приспособлений, обеспечивающих охлаждение микробных клеток со скоростью порядка 106°С/с. Объекты без предварительной химической фиксации или какой-либо иной обработки замораживали в жидком пропане, переохлажденном жидким
Рис. 1. Вид клеток и их агрегатов в 9-месячной культуре М. 1шеш. Фазово-контрастная микроскопия. Длина масштабной метки - 10 мкм.
азотом до температуры -196°С. Получение крио-сколов клеток проводили при достижении вакуума 3 х 10-4 Па и температуры образца -100°С. Реплики с поверхности скола получали путем нанесения в вакууме платино-углеродной смеси под углом 30° и укрепляющего слоя чистого углерода под углом 90°.
Ультратонкие срезы и реплики с поверхности сколов просматривали в электронном микроскопе ШМ-100Б (ХБОБ, Япония) при ускоряющем напряжении 60 кВ.
Действие лизоцима на покоящиеся клетки.
В культуры М. \uteus 5 и 6-месячного возраста добавляли лизоцим из яичного белка ( НПО "Био-химреактив") в концентрациях: 1, 10, 100 мкг/мл и инкубировали при 29°С в течение 20 мин. После этого проводили высевы соответствующих разведений на агаризованную синтетическую
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.