БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2012, том 38, № 3, с. 219-226
УДК 591.481:591.525+595.384 МОРФОЛОГИЯ
топография no и H2s систем в мозге
мохнаторукого краба ERIOCHEIR JAPONICA (DE HAAN, 1835) (decapoda: varunidae)1
© 2012 г. Е. П. Коцюба
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток 690059 e-mail: epkotsuba@mail.ru
Статья принята к печати 6.10.2011 г.
Гистохимическим и иммуноцитохимическим методами исследовали распределение и уровень активности ферментов синтеза оксида азота (NO) и сероводорода (H2S) в мозге мохнаторукого краба Eriocheir japonica (Decapoda: Varunidae), обитающего в пресной и морской воде. У особей, живущих в пресной воде, отмечено увеличение доли NO- и CBS-содержащих элементов в определенных нервных структурах мозга, что свидетельствует о совместном участии NO и H2S в центральной регуляции адаптивных механизмов при формировании компенсаторного ответа на изменение условий среды обитания. Предполагается, что сохранение баланса между системами оксида азота и сероводорода в мозге E. japonica играет важную роль в адаптации этого гидробионта к изменению химического состава среды обитания.
Ключевые слова: оксид азота, сероводород, цистатионин В-синтаза, краб, мозг, адаптация.
The topography of the No and H^ systems in the brain of the mitten crab Eriocheir japonica (De Haan, 1835) (Decapoda: Varunidae). E. P. Kotsyuba (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690059)
The distribution and activity of nitric oxide (NO) and hydrogen sulfide (H2S) synthesis enzymes in the brain of the mitten crab Eriocheir japonica (Decapoda: Varunidae) living in fresh water and seawater were studied by the histochemical and immunocytochemical methods. In crabs that live in fresh water, the share of NO- and CBS-containing nerve elements in certain brain structures was increased, indicating the joint participation of NO and H2S in the central regulation of adaptive mechanisms during the formation of a compensatory response to changing environmental conditions. It is likely that the preservation of balance between nitric oxide and hydrogen sulfide in the brain of E. japonica plays an important role in the adaptation of this species to changes in the chemical composition of the environment. (Biologiya Morya, 2012, vol. 38, no. 3, pp. 219-226).
Key words: nitric oxide, hydrogen sulfide, cystathionine В-synthase, crabs, brain, adaptation.
Среди множества сигнальных систем центральной нервной системы (ЦНС), вовлеченных в адаптивные реакции организма, важная роль принадлежит эндогенным газообразным посредникам - оксиду азота (NO) и сероводороду (H2S), действие которых направлено на сохранение внутриклеточного гомеостаза и контроль важнейших физиологических процессов в норме и при патологических состояниях (Hu et al., 2010; Yong et al., 2010). Наиболее изученным из них является оксид азота, синтезирующийся с помощью фермента NO-синтазы (NOS). Показано, что NOS находится в клетках позвоночных и беспозвоночных животных в колокализа-ции с флавиновым коферментом NADPH-диафоразой (NADPH-d); их активность изменяется в соответствии с изменением количества продуцируемого оксида азота (Dawson et al., 1991). Согласно современным представлениям, NO является универсальным регулятором метаболизма (Moncada et al., 1991) и маркером стресс-реакции (Smith et al., 2000), что позволяет использовать его в качестве показателя интенсивности неспецифического ответа на дестабилизирующие воздействия. Участие
NO в стрессовых и адаптивных реакциях установлено у разных таксономических групп животных, включая беспозвоночных. В экспериментальных исследованиях, выполненных главным образом на модельных видах беспозвоночных, показано, что повышение активности NO в ЦНС и гемолимфе при воздействии теплового стресса (Giovine et al., 2001), загрязнения пестицидами (Casares, Mantione, 2006) и хронического антропогенного загрязнения (Gonzalez et al., 2008; Vaschenko, Kotsyuba, 2008) может оказывать нейропротективное действие.
Сравнительно недавно появились данные об участии сероводорода в регуляции гомеостаза и о его ней-ропротективной роли при некоторых патологических состояниях: оксидативном стрессе (Kimura, Kimura, 2004) и гипоксии мозга (Tay et al., 2010) у млекопитающих. Механизмы, посредством которых реализуются нейро-протективные эффекты H2S, мало изучены, однако имеющиеся сведения позволяют говорить о взаимодействии NO и H2S систем. Известно, что повышение уровня H2S подавляет активность NO-синтазы и генерацию оксида азота (Zhong et al., 2003; Oh et al., 2006). В нервной
1 Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ДВО РАН (09-1-П16-04).
системе некоторых беспозвоночных животных эндогенный синтез H2S установлен (Watanabe et al., 2006), но топография Н^-позитивных клеток в ЦНС исследована только у прибрежного краба Hemigrapsus sanguineus (см.: Коцюба, 2011). Этих данных недостаточно для того, чтобы составить представление об особенностях организации и о возможностях адаптации системы H2S к изменяющимся условиям среды обитания. Между тем, можно ожидать, что NO- и Н^-ергические регуляторные механизмы наиболее эффективны в ЦНС беспозвоночных животных, в том числе высших ракообразных, обладающих широким диапазоном адаптации к различным факторам среды. Одним из таких представителей является повсеместно распространенный японский мохнато-рукий краб Eriocheir japonica, обитающий в морской, солоноватой и пресной воде, который способен длительно выдерживать аноксические условия.
Целью настоящей работы являлось сравнительное исследование NO- и Н^-синтезирующих структур в мозге краба E. japonica, обитающего в пресной и морской воде.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на половозрелых мужских особях краба Eriocheir japonica (De Haan, 1835) (Decapoda, Varanidae) с шириной карапакса 61-62 мм, отловленных в апреле 2009 г. в северо-западной части Японского моря в пресной (р. Киевка) и морской (б. Мелководная) воде. Мозг для исследований брали сразу после отлова животных.
Для гистохимического и иммуноцитохимического исследований мозг крабов фиксировали в течение 2 ч в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2) при 4°С. Затем ганглии помещали на сутки в холодный 30% раствор сахарозы на 0.1 М фосфатном буфере. Срезы толщиной 40 мкм изготавливали в криостате.
Для идентификации нитроксидергических структур использовали гистохимическую реакцию на NADPH-диафоразу (NADPH-d: НФ.1.6.99.1), методика которой описана нами ранее (Коцюба и др., 2010).
Для иммуноцитохимического выявления NO- и H2S-синтезирующих структур использовали метод непрямого авидин-биотин-пероксидазного маркирования. После инги-бирования эндогенной пероксидазы в 1% растворе H2O2 и подавления неспецифического связывания антител в 1% нормальной сыворотке лошади срезы инкубировали в течение 18 ч при 4°С с моноклональными антителами против циста-тионин ß-синтазы (CBS) (Abcam, Великобритания) в разведении 1 : 500, против нейрональной (nNOS) и индуцибельной (iNOS) NO-синтазы (Abcam, Великобритания) в разведении 1 : 100. Затем срезы промывали в нескольких сменах 0.1 М фосфатно-солевого буфера (PBS) (pH 7.2) и инкубировали 2 ч в растворе вторичных биотинилированных антител (Vector Labs, США) в разведении 1 : 200. После отмывания срезы инкубировали в течение 1 ч с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite АВС Kit, Vector Labs, США) при температуре 22-24°С в темноте, после чего их трижды промывали в PBS. Продукты реакции визуализировали при помощи субстрата (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США), контролируя процесс окраски под микроскопом. Затем срезы промывали в трех сменах PBS, обезвоживали по стандартной методике и
заключали в бальзам. Контроль реакций проводили, заменяя специфическую антисыворотку на нормальную; иммунопози-тивная реакция на контрольных срезах не обнаружена. В серии из последовательных срезов один срез обрабатывали 0.5% раствором метиленового синего для определения общего количества нейронов, другой срез использовали для гистохимического или иммуноцитохимического исследования.
Для количественного анализа иммунореактивных нейронов использовали автоматизированную систему анализа изображений Allegro-MC (Черток и др., 2003). Изображение срезов ганглия в световом микроскопе с 10-кратным увеличением при помощи цифровой фотокамеры (Sony) переносили на экран компьютера и вводили в окно программы Allegro-MC, где с помощью морфометрической "маски" выделяли имму-нореактивные структуры, находящиеся в проекции среза мозга. С помощью компьютерной программы определяли долю маркированных клеток (от общего числа нейронов в каждой клеточной группе), их размеры, оптическую плотность окраски нейронов и нервных волокон. При анализе количества маркированных клеток учитывали только те нейроны, плотность окраски которых была выше окраски фона в 1.25 раза и более. Уровень фона определяли в нервной ткани, не содержащей иммунореактивных структур, рядом с NO- и CBS-позитивными нейронами.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Данные количественного анализа представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (n = 5) при обработке 10 серийных срезов с каждого ганглия. Различия при уровне значимости p < 0.05 считали статистически достоверными.
При описании структур в основных отделах мозга: про-тоцеребруме, дейтоцеребруме и тритоцеребруме - использовали наиболее распространенную номенклатуру (Sandeman et al., 1992). В данном исследовании не рассматривали часть протоцеребрума, включающую расположенные в глазных стеблях оптические ганглии: lamina ganglionaris, medulla externa, medulla interna и medulla terminalis.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оксид азота
В мозге краба Eriocheir japonica, обитающего как в пресной, так и в морской воде, NADPH-d-позитивные нейроны выявляются в протоцеребруме и дейтоцеребруме. В протоцеребруме в центре переднедорсальной группы 6 обычно маркируются тела и отростки двух симметричных NADPH-d-позитивных нейронов разме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.