ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 2, с. 73-88
= ОБЗОРЫ =
УДК 577.95;575;591.3;592/599
ТРАДИЦИОННЫЕ И СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К КУЛЬТИВИРОВАНИЮ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ IN VITRO
© 2014 г. Е. Ю. Брусенцев1, Т. Н. Игонина1, С. Я. Амстиславский1 2
1 Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, пр. Лаврентьева, д. 10 2 Новосибирский государственный университет 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, д. 2 E-mail: amstis@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 28.03.13 г. Окончательный вариант получен 28.10.13 г.
В обзоре рассмотрены основные принципы и методы культивирования in vitro преимплантацион-ных зародышей млекопитающих. Описаны особенности развития зародышей in vitro присущие различным видам животных с учетом состава питательных сред, причем особое внимание уделено тем видам, которые традиционно считаются лабораторными, т.е. мышам, крысам и хомячкам. Анализируются эффекты субоптимальных условий культивирования преимплантационных эмбрионов на формирование фенотипа развившихся из этих эмбрионов особей. Анализируются новые подходы, направленные на оптимизацию условий развития преимплантационных эмбрионов млекопитающих in vitro.
Ключевые слова: культивирование in vitro, преимплантационные эмбрионы, факторы роста.
DOI: 10.7868/S0475145014020037
Культивирование in vitro гамет и преимплантационных эмбрионов млекопитающих является основой современных репродуктивных технологий, таких как ЭКО, создание банков (криобан-ков) генетических ресурсов и многих других так называемых "вспомогательных репродуктивных технологий" (assisted reproductive technologies). Хотя исследования в этой области проводятся достаточно длительный срок, до сих пор многие вопросы относительно влияния оплодотворения in vitro и последующего культивирования на развитие эмбриона и фенотипические признаки в постнатальном онтогенезе остаются неясными.
После рождения первого ребенка, зачатого в результате ЭКО (Steptoe, Edwards, 1978), прошло уже 35 лет и, общее число детей, рожденных с применением вспомогательных репродуктивных технологий, достигло 5 миллионов (Sandin et al., 2013). В настоящее время наряду с традиционным вариантом ЭКО, предполагающим минимальные воздействия на зародыши и гаметы и относительно небольшое время пребывания их в культураль-ных средах, все большее значение приобретают
более сложные технологии, такие как, например, ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) (Рожкова и др., 2012; Sandin et al., 2013). Более того, одной из основных тенденций в данной области, начиная с 2000-х гг., является более длительное культивирование полученных при посредстве ЭКО зародышей человека (Hardy, Spanos, 2002). Все это порождает запрос на изучение возможных отдаленных эффектов воздействия in vitro на стадии преимплантационного зародыша на последующий онтогенез, склонность к тем или иным заболеваниям, а также на поиск новых подходов к культивированию преимплантационных зародышей вне организма.
Имеются определенные технические и клинические сложности в изучении детей, рожденных в результате ЭКО и других репродуктивных технологий, в сравнении с обычными детьми (Hansen et al., 2005), поскольку методики ЭКО на протяжении 35 лет изменялись, и разные лаборатории придерживались не одинаковых протоколов, а также из-за молодого возраста подавляющего большинства детей, рожденных в результате ЭКО
(Watkins, Fleming, 2009). В связи с этим, особое значение приобретают экспериментальные работы на лабораторных животных, которые позволяют, как изучать эффекты культивирования пре-имплантационных эмбрионов в условиях in vitro, так и исследовать факторы, способствующие оптимизации этих условий.
Репродуктивные технологии активно применяют на лабораторных и сельскохозяйственных животных, что связано как с запросом на создание криобанков для сохранения генетических ресурсов редких и исчезающих видов животных, так и c ускорением генетического прогресса в сельском хозяйстве (Амстиславский, Трукшин, 2010; Amstislavsky et al., 2012). Эти технологии имеют своим элементом культивирование преимпланта-ционных эмбрионов in vitro. Наряду с исследованием видовой специфики, то есть специальных требований к условиям развития вне организма, характерных для того или иного вида млекопитающих (Herrick et al., 2007), имеются общие принципы культивирования эмбрионов животных in vitro. В нижеследующих разделах обзора дан критический анализ этих принципов, а также рассмотрена гипотеза о том, что здоровье и болезни определяются условиями пренатального онтогенеза. Наиболее полно представлены данные, полученные на традиционных лабораторных животных: мышах, крысах и золотистых хомячках. Кроме того, проанализированы эффекты субоптимальных условий in vitro на формирование фенотипа и представлены современные подходы, направленные на оптимизацию развития in vitro преимплантационных эмбрионов млекопитающих.
ГИПОТЕЗА DOHAD В СВЯЗИ С ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫМ ПЕРИОДОМ РАЗВИТИЯ
Представляется уместным упомянуть классические наблюдения Дэвида Баркера, который выявил взаимосвязь условий течения беременности, веса ребенка при рождении и последующего риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, диабета второго типа и других патологий. Барке-ром была сформулирована гипотеза о том, что здоровье и болезни взрослого человека определяются условиями его раннего онтогенеза, прежде всего — пренатального (Barker, 1995; Paneth, Süsser, 1995). Согласно гипотезе DOHaD (Developmental Origins of Health and Disease), адаптивные ответы на окружающие стимулы во время критических периодов пренатального онтогенеза могут иметь долговременные последствия из-за перепрограммирования ключевых систем регуляции гомео-стаза (Bateson et al., 2004). По отношению к пре-
имплантационным зародышам выделяют два основных аспекта в рамках данной гипотезы: "stress-response models" и "quiet embryo hypothesis" (Leese, 2012).
В исследованиях связанных с "stress—response models", изучают различные факторы стресса, которые могут испытывать преимплантационные зародыши при субоптимальных условиях их культивирования in vitro и связывают воздействия этих факторов с изменениями в метаболизме и характере развития эмбриона (Xie et al., 2011). " Stress—response models" включает в себя несколько моделей, которые образуют основу для описания метаболизма ооцита и преимплантаци-онного эмбриона во время стресса. Одной из таких моделей является направленное поддержание гомеостаза в условиях стресса, особенно в период дробления преимплантационного зародыша (Lane, Gardner, 2004). Другая модель показывает, что изменение среды, в которой развивается преим-плантационный эмбрион in vitro, может привести к нарушениям фенотипа, который формируются в постнатальном онтогенезе (Thompson et al., 2002). Значение последней модели заключается в том, что метаболизм преимплантационного эмбриона может быть изменен, задолго до нарушения в экспрессии генов, что, в конце концов, может приводить к аномальному развитию плода.
"Quiet embryo hypothesis", основана на том, что в норме системы поддержания гомеостаза в преим-плантационном эмбрионе препятствуют нарушению его метаболизма и проявлению деструктивных тенденций (Leese, 2002). Например, потребление кислорода является важным индикатором интенсивности метаболизма, так как основная часть АТФ необходимая для развития преимплантационного эмбриона образуется за счет процесса окислительного фосфорилирования. Преимплантационный эмбрион имеет сниженный метаболизм в отношении потребления кислорода, начиная со стадии зиготы до морулы (Leese, 2012), что позволяет избежать повреждений, вызванных образованием свободных радикалов. В исследованиях на пре-имплантационных эмбрионах коровы и свиньи было показано, что существует взаимосвязь между повреждением ДНК и интенсивностью метаболизма: чем выше был уровень обменных процессов у эмбрионов, тем больше было повреждений, и наоборот, эмбрионы с более низким уровнем метаболизма меньше подвергались повреждению (Baumann et al., 2007).
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Выделяют три типа питательных сред по способу получения и составу используемых для этого компонентов: естественные, полусинтетические и синтетические. Важными свойствами любой питательной среды являются: стерильность, а также постоянство рН (буферная емкость) и осмолярность. Для нормального развития преим-плантационного эмбриона in vitro необходимо поддерживать pH в интервале от 7.2 до 7.4; содержание эндотоксинов не должно превышать нормы (не более 0.25 ЕЭ/мл); раствор должен быть изотоничным жидкости яйцевода; в нем должны отсутствовать патогены.
Естественные питательные среды готовят из продуктов природного происхождения, например, эмбрионального экстракта (Hare, Morgan, 1954). Качественный и количественный состав данного типа сред может сильно варьировать, и их практически не используют для культивирования преимплантационных эмбрионов млекопитающих (Summers, Biggers, 2003).
Полусинтетические питательные среды создаются на основе искусственных растворов с известным составом с добавлением естественных компонентов, например, фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) (Han, Niwa, 2003). Их можно рассматривать как модифицированные варианты синтетических питательных сред.
Наибольшее же распространение при культивировании эмбрионов получили синтетические питательные среды. Одной из особенностей синтетических питательных сред является их точный качественный и количественный состав; они считаются "простыми", если содержат менее 12 компонентов, и, соответственно "сложными", если ингредиентов больше (Summers, Biggers, 2003; Lane, Gardner, 2007). При выборе компонентов и концентраций для их создания используются два основных подхода: "back-to-nature" и "let the embryo choose".
При первом подходе — "back-to-nature" изучают состав среды, которая присутствует при развитии эмбриона в репродуктивных путях. Согласно этому подходу, концентрация веществ в создаваемой синтетической среде базируется на знании состава компонентов естественной среды, в которой развиваются пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.