ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 7, с. 994-998
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.17:581.151:631.524.85
ТРАНСФОРМАНТЫ ТАБАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ АНТИСМЫСЛОВУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ГЕНА ПРОЛИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ, ПРОЯВЛЯЮТ УСТОЙЧИВОСТЬ
К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ
© 2007 г. Я. С. Колодяжная, С. Е. Титов, А. В. Кочетов, Е. А. Трифонова, А. В. Романова, М. Л. Комарова, В. С. Коваль, В. К. Шумный
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (383) 333-12-78; e-mail: jana_k@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 20.07.2006 г.
Проведен анализ устойчивости к повышенным концентрациям тяжелых металлов генетически модифицированных растений табака, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы и характеризующихся повышенным содержанием пролина. Показано, что потомки трансгенных растений характеризуются повышенной устойчивостью к солям свинца, никеля и кадмия.
Увеличение в почве содержания тяжелых металлов является серьезной экологической проблемой, влияющей на состояние окружающей среды и на здоровье человека. Тяжелые металлы, накапливаясь в растениях, тормозят рост корней, увеличивают проницаемость мембран, изменяют процессы вакуолизации цитоплазмы, повреждают процесс сборки микротрубочек, тормозят синтез ДНК, ингибируют процессы фотосинтеза, нарушают транспорт ассимилятов и минеральное питание, изменяют водный и гормональный статус организма и т.д. [1, 2]. В основе токсического действия лежит их способность связываться и образовывать прочные комплексы с серосодержащими соединениями. Однако при наличии токсических концентраций тяжелых металлов в почве растения способны включать различные механизмы детоксикации, что повышает (обеспечивает) их устойчивость к данному токсическому воздействию. Известно, что уровень пролина увеличивается в присутствии солей тяжелых металлов [3, 4]. Предполагают, что защитное действие пролина обусловлено его способностью взаимодействовать с макромолекулами, что приводит к сохранению их пространственной структуры и биологической активности [5]. Показано, что при обработке 5-дневных проростков пшеницы Triti-cum aestivum и фасоли Phaseolus aureus растворами, содержащими соли кадмия и ртути, происходит повышение уровня пролина [6]. При экспрессии зеленой микроводорослью Chlamydomonas reinhardtii гена А1-пирролин-5-карбоксилатсинта-зы фасоли, обеспечивающего повышенный синтез пролина, отмечена способность к выживанию в присутствии токсических концентраций ионов кадмия (100 мкМ). Уровень пролина коррелиро-
вал с уровнем малонилдиальдегида (МДА): у трансгенных растений, растущих в присутствии солей кадмия, наблюдалось повышенное содержание пролина, при этом уровень МДА был на 70% ниже. По-видимому, свободный пролин оказывает антиоксидантное действие [7]. При этом сродство тяжелых металлов к связывающим их соединениям различается в зависимости от физико-химических свойств иона, определяя их токсическое воздействие на рост и развитие растений [4].
Ранее нами на основе сорта SRI Nicotiana tabacum были получены трансформанты растений табака, экспрессирующие фрагмент гена пролиндегидрогеназы арабидопсиса, расположенный в антисмысловой ориентации. Анализ трансформантов показал, что такие растения характеризуются увеличенным содержанием пролина, повышенным осмотическим давлением клеточного сока и устойчивостью к засолению [8, 9]. В задачу настоящей работы входило исследование устойчивости к повышенным концентрациям некоторых тяжелых металлов у потомков трансформантов третьего поколения, полученных при самоопылении.
Для оценки устойчивости растений к повышенному содержанию ионов тяжелых металлов были проведены эксперименты по проращиванию семян опытной линии № 8 и сорта SRl (контроль) на среде Мурашиге и Скуга (MS) и на среде MS с добавлением хлорида кадмия (0.1, 0.2 мМ), нитрата свинца (0.1, 0.3 мМ) или сернокислого никеля (0.1, 0.2, 0.4 мМ). Такие концентрации были взяты на основании экспериментальных данных, представленных Kawashima [10]. На этих средах в условиях климатокамеры (21°C, 16-часовой световой день) растения выращивали в течение 2 мес.
K
Cd 0.1 мМ № 8
v i«^
Km
K
Cd 0.2 мМ № 8
Рис. 1. Рост табака на среде MS (в центре), на среде MS с добавлением 0.1 мМ (слева) и 0.2 мМ (справа) хлорида кадмия в течение 6 нед. К - контрольные растения.
№ 8 0.1 мМ РЬ К № 8 МБ К К 0.3 мМ РЬ № 8
Рис. 2. Рост табака на среде МБ (в центре) и на среде МБ с добавлением 0.1 мМ (слева) и 0.3 мМ (справа) нитрата свинца в течение 6 нед.
Эксперименты проводили в двух повторностях, объемы выборок составляли по 50-70 растений. Для статистической оценки влияния тяжелых металлов на рост опытных и контрольных растений была проведена оценка веса при помощи критерия достоверности выборочной разности [11]. Содержание хлорофилла a и b определяли по методу, описанному Шлыком [12]. Гомогенат, полученный при растирании 200 мг растительного материала с 3 мл 96%-ного этилового спирта, центрифугировали 3 мин при 3000 об/мин (центрифуга "Eppendorf MiniSpin"). Концентрацию определяли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 649 и 665 нм и рассчитывали по формулам:
схл a = 13.7 D665 - 5.76D 649,
Схл b = 25.8D665 7.6 D649?
где D - оптическая плотность исследуемых растворов.
При сравнении всхожести семян опытной и контрольной линий на среде MS и на среде MS с добавлением солей кадмия, никеля или свинца не выявлено достоверных отличий. Подсчет проводили на 14-15-е сут с момента посева. При выращивании растений на этих средах в течение 6-8 нед наблюдали видимые изменения.
Обнаружено, что рост растений сорта SR1 на среде MS с добавлением 0.1 мМ хлорида кадмия был замедлен в большей степени по сравнению с растениями-трансформантами; также были отмечены признаки начала хлороза (обесцвечивания побегов). При повышении концентрации хлорида кадмия до 0.2 мМ у нетрансгенных растений наблюдали полный хлороз листьев, тогда как у трансформантов хлороз листьев был выражен в значительно меньшей степени (рис. 1). При оценке веса контрольных и опытных растений, росших на средах, содержащих различные концентрации хлорида кадмия, была обнаружена достоверная разница между контрольными растениями сорта SR1 и трансформантами (данные не представлены).
Рост растений на среде MS, содержащей 0.1 мМ нитрата свинца, был замедлен и также наблюдались признаки хлороза. Однако рост трансформантов табака, несущих антисмысловой су-прессор пролиндегидрогеназы, был замедлен в значительно меньшей степени (рис. 2). При посеве семян на среду MS с добавлением 0.3 мМ нитрата свинца через 8 нед отмечена гибель растений и опытной, и контрольной линий, при этом растения-трансформанты имели визуально большие
996 КОЛОДЯЖНАЯ и др.
Влияние ионов никеля и кадмия на содержание хлорофилла а и Ь
Линия Среда Хлорофилл а, мг/г сырого веса Соотношение хлорофилла а/Ь Уменьшение содержания хлорофилла а в сравнении с МБ
Контроль МБ 4.33 2.12
№ 8 4.24 2.28
Контроль № 8 МБ + 0.2 мМ Cd 0.03 0.21 0.63 1.86 144 21
Контроль № 8 МБ + 0.1 мМ № 0.85 3.81 0.88 0.98 5.1 1.1
Контроль № 8 МБ + 0.3 мМ РЬ 0.11 0.46 0.77 0.63 39.4 9.2
размеры, характеризовались большим весом, признаки хлороза у них были выражены слабее (таблица, рис. 2, 3).
Присутствие в среде MS 0.1 мМ сульфата никеля существенно замедляло рост контрольных растений и практически не сказывалось на росте трансформантов (рис. 3, 4), при этом визуально признаков хлороза не отмечено в обоих случаях. Концентрация 0.2 мМ ингибировала рост контрольных растений и трансформантов в равной степени, и измерения биомассы не выявили до-
Средний вес, мг 250
200
150
100
50
0
□ К
□ № 8
5 гш IВ Ра
МБ 0.1 0.2 0.1 0.3 0.1 0.2 Cd Cd РЬ РЬ № № Концентрация ионов металлов, мМ
стоверных отличий (данные не представлены). При росте на среде с добавлением 0.4 мМ сернокислого никеля всходы погибали сразу после прорастания.
Мы также провели анализ содержания хлорофилла в нетрансгенных растениях и в трансформантах. Количественная оценка показала, что при выращивании на среде с 0.2 мМ хлорида кадмия растения-трансформанты содержали в 7 раз больше хлорофилла а, чем нетрансгенные растения (таблица). Также наблюдалось достоверное изменение соотношения хлорофилла а/Ь, что может, по-видимому, являться адаптивной реакцией ассимиляционного аппарата растений табака на присутствие токсичных ионов тяжелых метал-
Рис. 3. Средний вес растений (в возрасте 6 нед) на среде МБ и на МБ с добавлением солей ТМ.
Рис. 4. Рост табака на среде с добавлением 0.1 мМ никеля в течение 6 нед. (слева), справа - контроль.
лов. Большая разница между опытными и контрольными растениями обнаружена при выращивании на среде с добавлением сернокислого никеля. Измерения концентрации хлорофилла у растений-трансформантов, росших на среде МБ и на среде МБ с добавлением сернокислого никеля, не выявили значительных различий в соотношении хлорофиллов а и Ь. При этом по сравнению с растениями, выращенными на среде без добавления соли, содержание хлорофилла а снизилось у контрольных растений в 5 раз, а у трансформантов - только в 2 раза. Соотношение хлорофилла а и Ь как у опытных, так и у контрольных растений было достоверно снижено. Снижение содержания хлорофилла обнаружено также при выращивании на средах, содержащих нитрат свинца (таблица).
Анализируя все проведенные эксперименты и располагая металлы в порядке убывания их токсического действия, мы можем составить следующий ряд по уменьшению токсичности: Cd > № > РЬ. В литературе описаны другие ряды: например, Cd > РЬ > №, что, по-видимому, связано с различной устойчивостью разных видов растений. Но во всех случаях кадмий показывает большую степень токсичности [4]. Следует учесть, что эксперименты проводили, выращивая растения табака на среде МБ, содержащей стандартный набор микро- и макроэлементов. Возможно, реакция растений на присутствие солей тяжелых металлов зависит от типа среды, и при проведении аналогичных экспериментов с растениями, выращенными в почве или на других питательных средах, количественные оценки уровня стрессоустойчивости трансформантов в сравне
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.