АГРОХИМИЯ, 2015, № 2, с. 79-85
УДК 633.71:632.122.1:546.621
ТРАНСФОРМАНТЫ ТАБАКА С ГЕНОМ Fe-СОД! КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФОРМИРОВАНИЯ АЛЮМОУСТОЙЧИВОСТИ
© 2015 г. И.Г. Широких1, 2, С.Ю. Огородникова2, Е.Н. Баранова3, Я.И. Назарова1,
А.А. Гулевич3
1,2Зональный научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока
им. Н.В. Рудницкого 610007 Киров, ул. Ленина, 166 а, Россия E-mail: irgenal@mail.ru
2Лаборатория биомониторинга Института биологии Коми НЦ и Вятского государственного
гуманитарного университета 610002 Киров, ул. Красноармейская, 26, Россия 3Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии 127550 Москва, ул. Тимирязевская, 42, Россия
Поступила в редакцию 20.10.2014 г.
Независимые трансгенные линии табака (Nicotiana tabacum L.) Ttrf 2 и Ttrf 13 с геном Fe-содержа-щей супероксиддисмутазы (Fe-СОД!) из Arabidopsis thaliana были использованы для выяснения возможного влияния экспрессии гетерологичной последовательности на усиление адаптивных реакций растений к стрессу, обусловленному токсичностью алюминия в кислой почве. Для оценки изменения чувствительности трансформантов к алюминию проведены биохимические тесты, отражающие интенсивность перекисных процессов, суммарную активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, содержание в листьях пластидных пигментов. По реакции на алюминий трансгенные линии табака существенно различались между собой. В листьях трансформанта Ttrf 13 на фоне стресса интенсивность перекисного окисления липидов не увеличивалась, общая активность супероксиддисмутазы была в 1.1-1.6 раза больше, содержание хлорофиллов и кароти-ноидов соответственно на 23-70% и 11-32% больше, чем в обычных условиях. В листьях исходного сорта и трансформанта Ttrf 2, напротив, количество пластидных пигментов при стрессе было меньше, а накопление малонового диальдегида (МДА) в листьях в 1.6-2.2 раза больше, чем в контроле. Рассмотрены возможные причины отсутствия стабильной экспрессии гена Fe-СОД1 линией Ttrf 2. Сделан вывод о перспективности использования гена Fe-СОД1 из Arabidopsis thaliana для генно-инженерной защиты фотосинтетического комплекса растений от окислительного стресса, обусловленного токсичностью алюминия в кислых почвах.
Ключевые слова: трансформанты табака (Nicotiana tabacum L.), ген ^е-СОД1, формирование алюмоустойчивости.
ВВЕДЕНИЕ
Кислые почвы распространены во всем мире. Два основных географических пояса распространения кислых почв включают в себя влажные таежные леса северной Евразии (9.9%) и влажные тропики Американского континента (40.9%), Азии (26.4%), Африки (16.7%), Австралии и Новой Зеландии (6.1%). Таким образом, почти 70% мирового фонда пахотных земель имеют кислую реакцию [ 1 ], что прино сит значительный ущерб, ограничивая сбор урожая сельскохозяйственных культур.
Культурные растения на кислых почвах, помимо дефицита питательных веществ, зачастую
испытывают стресс, обусловленный токсичностью ионов алюминия [2]. Прогресс в понимании механизмов алюмоустойчивости позволяет создавать толерантные формы и линии с использованием методов генной инженерии [3]. Клонированы гены, контролирующие корневую экскрецию органических анионов - малата [4, 5] и цитрата [6-8], которые связывают токсичные ионы во внеклеточном пространстве; и гены белков-транспортеров [9, 10], повышающих резистентность при попадании алюминия в апопласт.
Одним из механизмов цитотоксического действия алюминия является окислительный стресс [11, 12]. К числу ключевых компонентов
системы защиты клеток и тканей от окислительной деструкции относится антиоксидантный фермент супероксиддисмутаза (СОД) КФ 1.15.1.1 [13]. СОД катализирует реакцию дисмутации супероксидных анион-радикалов до молекулярного кислорода и пероксида водорода. Супероксидные анион-радикалы могут вызывать прямые повреждающие эффекты, а также быть источником образования других, в том числе и более токсичных форм кислорода. Поэтому клетка нуждается в строгом контроле над процессами генерации и своевременного удаления данных радикалов.
Антиокислительную активность внутри клетки можно значительно повысить, внедрив в геном реципиентного растения ген фермента СОД с промотором, обеспечивающим высокий уровень экспрессии во всех органах и тканях. Генетически модифицированные культуры с суперэкспрессией гена СОД - табак [14], кукуруза [15], арабидоп-сис [16], томат [17, 18] - демонстрировали большую, в сравнении с обычными растениями, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды.
В клетках растений СОД существует в виде трех изоформ (Си^п-СОД, Мп-СОД, Бе-СОД), различающихся ионами металлов в активном центре и локализацией в определенных органеллах [19]. Изоформа Бе-СОД преимущественно локализована в хлоропластах, где представлена типами Бе-СОД2 и Бе-СОД3. В нефотосинтезирующих органеллах и тканях обнаружена локализация фермента Бе-СОД1: в пе-роксисомах, цитоплазме клубеньков некоторых бобовых культур, цитоплазме клеток Arabidobsis thaliana [13].
В отличие от ряда других изоформ и типов СОД, участие которых в защите растений от окислительного стресса, обусловленного алюминием, было предметом исследования ранее [20-22], роль Бе-СОД1 в формировании устойчивости растений к алюминию до сих пор не рассматривали. Удобной моделью в исследовании возможного участия Бе-СОД1 в формировании устойчивости к токсическому действию алюминия в кислых почвах могут быть трансгенные по гену Бе-СОД1 растения.
Цель работы - сравнительная оценка реакции на воздействие ионов Н+ и А13+ трансгенных и нетрансгенных растений табака при помощи данных об интенсивности перекисных процессов, суммарной активности антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, содержании в листьях пластидных пигментов.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали табак обыкновенный (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун и полученные путем агробактериальной трансформации независимые трансгенные линии Ttrf 2 и Ttrf 13 с геном, кодирующим цито плазматическую Fe-со-держащую супероксиддисмутазу (Fe-СОД!) из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Выбор данной изоформы антиоксидантного фермента был определен тем, что экспрессия Fe-СОД 1 не приводит к нарушению структуры пластид в отличие от аналогичных экспериментов с Fe-СОД2 и Fe-СОДЗ [23]. Ген Fe-СОД! был снабжен в генно-инженерной конструкции сигнальной последовательностью гена rbсS гороха (Pisum sativum L.), направляющей его белковый продукт в пластиду, поскольку при большинстве стрессов для сохранения нормальной жизнедеятельности растительной клетки хлоропласты являются одним из наиболее значимых компартментов.
Клональное микроразмножение пробирочных растений исходного сорта Самсун и линий Ttrf 13 и Ttrf 2, трансгенность которых была доказана с использованием селективной среды и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводили на среде Мурасиге-Скуга [24], а после образования развитой корневой системы высаживали в вегетационные сосуды с почвой (2 растения на сосуд, 2 сосуда в каждом варианте) и выращивали в летний период при естественном световом и температурном режиме. Для оценки устойчивости табака к токсичности алюминия использовали природную дерново-подзолистую почву с рНкс1 3.6 и содержанием подвижного алюминия 12.8 мг/100 г. Контролем служили растения, выращенные в сосудах, заполненных торфяно-перег-нойной смесью с рН 6.0 без алюминия.
Биохимические показатели в смешанных пробах листьев определяли в фазы развития растений: укоренение рассады, формирование растений и цветение. Аналитическая повторность в каждом варианте опыта была трехкратной.
Активность СОД определяли методом, основанном на способности фермента ингибировать фотохимическое восстановление я-нитротетразо-лиевого синего (NBT). В присутствии рибофлавина и метионина, генерирующих супероксидные анион-радикалы, NBT восстанавливается до синего формазана с максимумом поглощения при 560 нм [25]. Реакционная смесь (3 мл) содержала: 1.3 мкМ рибофлавина, 13 мМ метионина, 63 мкМ NBT в 0.05 М Na-фосфатном буфере с 0.10 мМ EDTA и рН 7.8, 0.1 мл ферментативного экстрак-
ТРАНСФОРМАНТЫ ТАБАКА С ГЕНОМ Fe-СОД!.
81
та. Образцы освещали в течение 6 мин. Измерения проводили на спектрофотометре "Spekol 1200". За единицу активности СОД принимали объем ферментативного экстракта, который вызывал 50%-ное ингибирование фотовосстановления NBT. Определение активности СОД проводили в трехкратной повторности. Активность СОД рассчитывали на 1 г сырой массы.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в листьях растений анализировали по содержанию малонового диальдегида (МДА), определенного в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Навеску растительной ткани массой 0.6 г гомогенизировали в 10 мл ТРИС-НС1 буфера рН 7.6 в концентрации 0.1 моль/л, содержащего 0.35 моль NaCl/л. К 3 мл гомогената добавляли 2 мл 0.5%-ной ТБК в 20%-ной ТХУ. Полученную смесь нагревали при 100 °С в течение 30 мин, быстро охлаждали и фильтровали [26]. Измеряли оптическую плотность фильтратов при 532 нм. Концентрацию МДА рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 1.56 • 10-5 М-1 см-1.
Для определения содержания пластидных пигментов сегменты из средней части листьев (0.15 г) фиксировали кипящим 100%-ным ацетоном (2-3 мл) и растирали с добавлением CaCO3 (для нейтрализации кислот клеточного сока) и Na2CO3 (для обезвоживания пробы от воды, содержащейся в растительной клетке). Гомогенат фильтровали, и объем доводили ацетоном до 25 мл [27]. В ацетоновой вытяжке определяли содержание хлорофиллов а и б на спектрофотометре "Specol" (Германия) при длинах волн 662, 644 (хлорофиллы) и 440.5 нм (каротиноиды). Величины коэффициентов вариации для содержания в листьях хлорофиллов а, б и каротиноидов были не < 8%.
Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами с использованием встроенного пакета программ EXCEL. На графиках представлены средние величины и их стандартные отклонения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для характеристики функционального состояния растений табака при стрессе, обусловленном токсичностью алюминия в кислой почве, использовали пока
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.