ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 4, с. 358-363
УДК 577.66:579.222
ТРАНСФОРМАЦИЯ 2- И 4-ЦИАНОПИРИДИНОВ СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
© 2013 г. Ю. Г. Максимова*, Д. М. Васильев**, Г. В. Овечкина*, А. Ю. Максимов*, **, В. А. Демаков*, **
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081; e-mail: maks@iegm.ru **Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990
Поступила в редакцию 25.12.2012 г.
Изучена динамика трансформации 2- и 4-цианопиридина суспендированными и адсорбированными на неорганических носителях клетками штамма Rhodococcus ruber gtl, обладающего нитрилгид-ратазной активностью, и Pseudomonas fluorescens C2, содержащими нитрилазу. Определено, что и нитрилгидратазная, и нитрилазная активность по 2-цианопиридину у иммобилизованных клеток в 1.5—4 раза ниже, чем таковая по 4-цианопиридину, и в 1.6—2 раза ниже, чем активность свободных клеток по 2-цианопиридину. Показана возможность получения изоникотиновой кислоты при совместной конверсии 4-цианопиридина смешанной суспензией клеток штамма R. ruber gt1 с высокой нитрилгидратазной активностью и R. erythropolis 11-2 с выраженной амидазной активностью. Показано, что иммобилизация клеток родококков на угле-сырце и клеток псевдомонад на каолине позволяет получить гетерогенный биокатализатор для эффективной трансформации цианопиридинов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты.
Б01: 10.7868/80555109913040089
Пиридинзамещенные амиды и карбоновые кислоты — предшественники ряда фармацевтических препаратов и различных востребованных в народном хозяйстве химических соединений. Изо-никотиновая кислота является промежуточным продуктом в синтезе ряда противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты (изониазид, фтивазид, метазид и др.), антидепрессантов — ингибиторов моноаминооксидазы, хинуклидиновых лекарственных средств (фенка-рол, оксилидин, ацеклидин). Некоторые производные пиколиновой кислоты, в частности 6-метилпи-колиновая кислота, — промежуточные продукты в синтезе фармацевтических препаратов, например димеколина [1]. Высокоактивные гербициды лон-трел и пиклорам — хлор- и аминозамещенные производные пиколиновой кислоты [2].
Основным природным источником пиридиновых соединений являются продукты коксования каменного угля. В химико-фармацевтическом производстве Р-пиколиновую фракцию (предшественник никотинамида и никотиновой кислоты), содержащуюся в коксовом газе, подвергают конденсации в жестких условиях под давлением с формалином. Присутствующую в ней у-пиколиновую фракцию (предшественник изоникотиновой кислоты) отделяют формалином с последующей отгонкой и окислением азотной
кислотой [1]. Известен также химический гидролиз цианопиридинов, который инициируется повышенной температурой и характеризуется неконтролируемой экзотермичностью [3]. Так, никотиновую кислоту получают химическим синтезом, включающим стадию окисления 2-ме-тил-5-этилпиридина, или гидролизом 3-циано-пиридина при высоких температурах (330°С) и давлении (290 атм.) [4]. Биологический способ получения ароматических амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, основанный на ферментативном гидролизе, выгодно отличается от химического мягкими условиями проведения процесса, экологической безопасностью и высокой степенью конверсии.
Ферментативный гидролиз цианопиридинов до соответствующих амидов и карбоновых кислот осуществляется ферментами нитрилгидратазно-амидазной и нитрилазной систем микроорганизмов. Способность к трансформации ароматических нитрилов встречается как у представителей родов бактерий Rhodococcus, Nocardia, Arthro-bacter, Agrobacterium, Microbacterium, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acine-tobacter [4—7], так и среди грибов родов Fusarium, Giberella, Aspergillus, Pinicillum, Talaromyces и др. [8]. Известны биотехнологические процессы, основанные на гидролизе алифатических нитрилов.
Так, компанией "Биоамид" (г. Саратов, Россия) был внедрен процесс, заключающийся в биокаталитическом производстве акрилата аммония из нитрила акриловой кислоты штаммом Alcali-genes denitrificans C-32 — продуцентом нитрилазы (КФ 3.5.5.1) [9]. Крупнотоннажное производство акриламида основано на гидратации акрилонит-рила клетками штамма R. rhodochrous J1 (Япония) [10] и штамма R. rhodochrous М8 (Россия) [11], обладающими высокой нитрилгидратазной активностью. Промышленно значимый штамм R. rhodochrous J1 также применяется в биокаталитическом производстве никотинамида, причем в зависимости от культуральной среды он может продуцировать нитрилгидратазу (КФ 4.2.1.84) или нитрилазу. Известно, что нитрилаза этого штамма проявляет высокое сродство к 4-циано-пиридину, хотя неактивна по отношению к 2-ци-анопиридину [12, 13]. В отличие от процесса получения никотинамида и никотиновой кислоты ферментативным путем, в научной литературе недостаточно описано биокаталитическое получение изоникотиновой и пиколиновой кислот, а также нет сведений об их успешном синтезе с выходом на промышленный уровень. При трансформации 2- и 4-цианопиридинов представляет интерес получение пиридинзамещенных карбоновых кислот, а не амидов, что может быть осуществлено штаммом микроорганизмов, содержащим активную нитрилазу, либо нитрилгидратазно-амидазную ферментную систему с амидазой (КФ 3.5.1.4), сравнимой по активности с нитрилгидратазой. Одним из решений данной задачи может быть разработка биокатализатора в виде смешанных бактериальных культур.
Цель работы — поиск наиболее предпочтительных путей биокаталитического получения изоникотиновой и пиколиновой кислот из соответствующих цианопиридинов, а также разработка гетерогенного биокатализатора на основе ад-сорбционно-иммобилизованных нерастущих клеток нитрилгидролизующих бактерий.
МЕТОДИКА
Штаммы нитрилутилизирующих бактерий R.. ruber gt1 [14], P. fluorescens C2, R. erythropolis 112, выделенные из образцов почв, выращивали в колбах объемом 1 л на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин при 30°С на минимальной солевой среде следующего состава (г/л): КН2РО4 — 1.0, К2НРО4 • 3Н2О - 3.7, NaCl - 0.5, MgSO4 • 7Н2О - 0.5, FeSO4 • 7Н2О - 0.005, CoCl2 • 6Н2О - 0.01, рН 7.27.4. В качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0.1%. Источником азота для штамма R. ruber gt1 являлся хлористый аммоний в концентрации 10 мМ, для P. fluorescens C2 и R. erythropolis 11-2 - ацетонитрил в концентрации 0.5 и 0.05% соответственно.
Трансформацию 100—200 мМ растворов 2- и 4-цианопиридинов осуществляли в 10—20 мл калий-фосфатного буфера (pH 7.2 ± 0.2) при 30°С в течение
I—48 ч. В качестве катализатора вносили отмытые калий-фосфатным буфером клетки R. ruber gt1 (0.6 мг/мл) и P. fluorescens C2 (2.6 мг/мл), выращенные до стационарной фазы роста, в которой данный штамм родококков проявляет максимальную нит-рилгидратазную, а штамм псевдомонад — максимальную нитрилазную активность. Культуру R. erythropolis 11-2 выращивали до поздней логарифмической фазы роста, в которой данная культура проявляет максимальную амидазную активность. Совместную трансформацию субстратов осуществляли отмытыми клетками R. rubergt1 и R. erythropolis
II-2, вносимыми в реакционную среду в соотношении 11/13.5 мг по сухой массе. Реакцию проводили в 22 мл калий-фосфатного буфера в течение 3 ч: 1ч при 30°С и 2 ч при 50°С.
Удельную активность нитрилгидратазы и нитрилазы выражали в ммолях амида (карбоновая кислота)/г сухих клеток • ч.
Адсорбционную иммобилизацию клеток штамма P. fluorescens C2 на каолине ("Merck", Германия) и R. rubergt1 на измельченном до порошкообразного состояния угле-сырце с размером частиц 50— 300 мкм (Россия) проводили в течение 1 ч при 30°C при перемешивании на шейкере при 140 об/мин, носитель отделяли на фильтре ("синяя лента"), отмывали калий-фосфатным буфером и учитывали количество несвязавшихся клеток. Трансформацию цианопиридинов иммобилизованными клетками проводили в тех же условиях, как и реакцию, катализируемую суспендированными клетками. Концентрация иммобилизованных и суспендированных (в пересчете на сухую массу) клеток в реакционной среде была одинакова.
Концентрацию изоникотиновой и пиколино-вой кислот определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 ("Shimadzu", Япония) с колонкой Luna 5u C 18(2) 100A (250 х 4.6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ KH2PO4 и 25% ацетонитрила, скорость потока составляла 0.5 мл/мин при 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм.
Адсорбцию 100 мМ растворов 2-, 4-цианопи-ридинов, пиколинамида и пиколиновой кисло -ты, изоникотинамида и изоникотиновой кислоты на угле-сырце и каолине определяли по разнице концентрации этих веществ в надосадочной жидкости после 2 ч инкубации с 500 мг носителя при 30°C.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Microsoft Excel 2003 с использованием t критерия Стьюдента, результаты представлены средними величинами по трем независимым опытам. Уровень значимости а принимали равным 0.05.
Активность суспендированных и иммобилизованных нитрилутилизирующих бактерий по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч
Образец 2-цианопиридин 4-цианопиридин
R. ruber gtl, нитрилгидратазная активность
Суспензия 887.70 ± 106.43 803.70 ± 53.51
Иммобилизо- 460.20 ± 84.74 702.40 ± 25.49 ванные клетки
P. fluorescens C2, нитрилазная активность
Суспензия 8.81 ± 1.18 19.63 ± 1.65
Иммобилизо- 5.35 ± 1.37 21.53 ± 3.32
ванные клетки
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Трансформация 2- и 4-цианопиридина суспендированными и иммобилизованными клетками штамма R. ruber gt1, содержащими нитрил гидратазу.
Суспензия клеток R. ruber gtl и адсорбированные на угле-сырце клетки трансформировали 2- и 4-цианопиридин до пиколинамида и изоникотина-мида соответственно. Нитрилгидратазная активность суспендированных клеток по этим субстратам достоверно не различалась, а при иммобилизации наблюдалось незначительное снижение активности по 4-цианопиридину (таблица). В то же время активность по 2-циа-нопиридину у иммобилизованных клеток была ниже, чем у с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.