ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 1, с. 53-58
УДК 579.66:579.222
ТРАНСФОРМАЦИЯ АМИДОВ АДГЕЗИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ РОДОКОККОВ, ОБЛАДАЮЩИМИ АМИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
© 2015 г. Ю. Г. Максимова*, А. Н. Горбунова*, А. С. Зорина***, А. Ю. Максимов*, **,
Г. В. Овечкина*, В. А. Демаков* **
*Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 614081;
e-mail: maks@iegm.ru
**Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, 614990 ***Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, 614990
Поступила в редакцию 18.04.2014 г.
Адгезией амидазосодержащих клеток родококков на березовом активном угле (БАУ) и угле-сырце получен гетерогенный биокатализатор для гидролиза амидов. Изучены свойства полученного биокатализатора в реакции гидролиза акриламида до акриловой кислоты и никотинамида до никотиновой кислоты, а также в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до D- и L-изомеров молочной кислоты. Показано, что при повышении концентрации адгезированных и суспендированных клеток в 6 и 3 раза соответственно амидазная активность снижалась в 3 и 30 раз соответственно. Адге-зированные на БАУ клетки сохраняли более 50% активности на протяжении семи 24-часовых циклов гидролиза акриламида, тогда как суспендированные клетки теряли более 60% активности уже во втором цикле. Отмечено, что при адгезии клеток на БАУ снижалась стереоселективность реакции гидролиза рацемического лактамида.
DOI: 10.7868/S0555109914060105
Уникальные свойства ферментов микроорганизмов (хемо-, регио- и энантиоселективность, высокая удельная активность и стабильность), гидролизующих нитрилы, позволяют получать биотехнологическим путем в килотонных объемах такие продукты, как акриламид и никотина-мид, а также разрабатывать процессы синтеза карбоновых кислот и стереоизомеров для получения фармакологических препаратов и соединений, труднодоступных для традиционного органического синтеза [1].
Амидазы (КФ 3.5.1.4) прокариот, наряду с нит-рилгидратазами, участвуют в двустадийном процессе гидролиза нитрилов, обеспечивая гидролиз амидов, образующихся из нитрилов, с образованием соответствующей карбоновой кислоты и аммония. Благодаря широкой субстратной специфичности и стереоселективности амидазы обладают потенциалом для использования их в качестве биокатализаторов в органическом синтезе [2, 3]. Эти ферменты особенно важны при разработке процессов синтеза энантиомерно чистых аминокислот, нестероидных противовоспалительных препаратов, оптически активных 2-арилпропионовых кислот из соответствующих рацемических амидов аминокислот, а также могут быть использованы для получения акриловой кислоты из акриламида [4].
Большинство известных в настоящее время амидаз были обнаружены и описаны у бактерий родов Шойососст, СогупвЬас1вгшт, МуеоЬас1вп-
um, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Brevibacte-rium, Nocardia, Streptomyces, Blastobacter, Arthro-bacter, Alcaligenes, Helicobacter, Lactobacillus и Me-thilophilus [5, 6]. Амидазы обычно функционируют в узком диапазоне рН и температур, что затрудняет их использование в биокатализе. В этом случае иммобилизация клеток микроорганизмов, обладающих амидазной активностью, обеспечивает некоторые преимущества, заключающиеся в устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды и токсичным веществам, а также возможности длительного использования биокатализатора в условиях непрерывного процесса [4].
В отличие от данных об иммобилизованных биокатализаторах на основе клеток микроорганизмов с нитрилгидратазной и нитрилазной активностью сведений о получении и изучении свойств иммобилизованных биокатализаторов, обладающих амидазной активностью, недостаточно. Так, клетки Delftia tsuruhatensis CCTCC M205114, инкапсулированные в альгинат кальция, осуществляли энан-тиоселективный гидролиз (R)-2, 2-диметилцикло-пропанкарбоксамида из рацемической смеси, приводя к накоплению S-амида, являющегося ключевым интермедиатом циластатина [7]. Клетки Pseudomonasputida MTCC 6809, включенные в структуру геля альгината кальция, использовали как продуцент амидазы [4]. Для образования никотиновой кислоты из никотинамида, катализируемого амидазой Microbacterium imperiale
CBS 498—74, использовали мембранный реактор [8]. Клетки P. aeruginosa, содержащие амидазу, иммобилизовали методом обращенных мицелл в системе катионного поверхностно активного вещества бромида тетрадецилтриметил аммония в гептане/октаноле [9]. Целые клетки Rhodococcus equi A4, проявляющие нитрилгидратазную и амидазную активность, были иммобилизованы в гранулах гидрогеля сополимера поливинилового спирта и полиэтиленгликоля ("LentiKats®", Чехия). Полученный биокатализатор был использован для биотрансформации бензонитрила, 3-цианопиридина, ^,^)-3-гидрокси-2-мети-ленбутанонитрила и ^,^)-гидрокси-2-метилен-3-фенилпропанонитрила до соответствующих кислот [10]. Основное внимание было уделено включению содержащих амидазу клеток микроорганизмов в структуру таких гелей, как альги-нат, агар, полиакриламид и поливиниловый спирт/альгинат [11, 12]. Хотя работ, посвященных адсорбционной иммобилизации клеток бактерий, обладающих амидазной активностью, в литературе практически не встречается, этот способ иммобилизации обладает определенными преимуществами перед включением в массу носителя, т.к. позволяет избежать диффузионных затруднений. Он является технически более простым и менее дорогим и имеет преимущества при масштабировании в промышленных объемах.
Цель работы — разработка гетерогенного биокатализатора для гидролиза амидов до соответствующих карбоновых кислот на основе адгези-рованных клеток родококков и изучение его активности по отношению к алифатическим и ароматическим амидам и стереоселективности в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до L и D-молочной кислоты.
МЕТОДИКА
Штаммы утилизирующих нитрилы бактерий R.. erythropolis 11—2, R. erythropolis 6—2 и R. rhodoch-rous 4—1 выделены из образцов почв и селекционированы в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии Института экологии и генетики микроорганизмов (УрО РАН). Выращивание штаммов проводили в колбах объемом 1.0 л на качалке со скоростью вращения 100 об/мин при 30°С на минимальной солевой среде, рН 7.2—7.4, следующего состава (г/л): КН2РО4 — 1.0, К2НРО4 • 3Н2О - 3.7, NaCl - 0.5, MgSO4 • 7Н2О -0.5, FeSO4 • 7Н2О - 0.005, CoCl2 • 6Н2О - 0.01. В качестве источника углерода добавляли 0.1% глюкозы, в качестве источника азота - 0.1% аце-тонитрила.
Адсорбцию клеток (из 10 мл бактериальной суспензии) проводили на 500 мг березового активного угля (БАУ, "УралХимСорб", Россия), 200 мг по-
рошкообразного угля-сырца (размер частиц 50— 300 мкм) и 500 мг дробленого угля-сырца (размер фракций 1—6 и 3—10 мм) в течение 30 мин при 22°С. Для определения массы клеток 1.0 мл суспензии высушивали до постоянной массы. Количество адгезированных клеток определяли по формуле:
А = (ОДисх - ОДфильтр)/ОДисх Х м,
где: А — количество адгезированных клеток (мг); ОДисх — оптическая плотность при 540 нм суспензии клеток до адсорбции; ОДфильтр — оптическая плотность при 540 нм суспензии клеток после адсорбции; м — концентрация клеток в суспензии до адсорбции (мг/мл). Носитель с адгезирован-ными клетками отмывали 0.1 М калий-фосфатным буфером, рН 7.2 ± 0.2.
Визуализацию иммобилизованных клеток проводили с использованием сканирующего электронного микроскопа MIRA 3 ("TESCAN", Чехия) при ускоряющем напряжении 10 кВ. Электронно-микроскопический анализ образцов выполнен в демонстрационно-методическом центре TESCAN (г. Санкт-Петербург).
Трансформацию 100 мМ акриламида и 200 мМ никотинамида проводили в 10 мл 0.1 М калий-фосфатного буфера, рН 7.2 ± 0.2, при 30°С на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Реакцию останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации 2%.
Операционную стабильность биокатализатора на основе суспендированных и адгезированных на БАУ клеток оценивали по сохранению амидаз-ной активности при проведении последовательных 24-часовых циклов конверсии акриламида, с концентрацией 100 мМ. После каждого цикла отбирали пробу для определения продукта реакции. Свободные клетки отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 10 000 g, ресуспендирова-ли в 0.1 М калий-фосфатном буфере, рН 7.2 ± 0.2, повторно центрифугировали и использовали в следующем цикле. Адгезированные клетки отмывали однократно 0.1 М калий-фосфатном буфером, рН 7.2 ± 0.2.
Концентрацию акриловой кислоты и акриламида определяли методом ВЭЖХ на колонке (250 х х 4.6 мм) Synergi 4u Hydro—RP 80A (хроматограф LC-10, "Shimadzu", Япония). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH2PO4, скорость потока 0.75 мл/мин при 25°C. Для определения концентрации никотиновой кислоты и никотина-мида использовали колонку Luna 5u C 18(2) 100A (250 х 4.6 мм), в качестве подвижной фазы — 10 мМ KH2PO4, с 25% ацетонитрила со скоростью 0.5 мл/мин при 25°C. Детекцию проводили при 200 нм. Стереоселективную трансформацию 50 мМ лактамида проводили в 0.1 М калий-фосфатном буфере (рН 7.2±0.2) в течение 1 ч при 22°С.
ТРАНСФОРМАЦИЯ АМИДОВ АДГЕЗИРОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ РОДОКОККОВ
55
Рис. 1. Адгезия клеток R. erythropolis 11-2 на БАУ (а) и угле-сырце (б).
D- и L-изомеры молочной кислоты определяли спектрофотометрически при 340 нм на планшетном ридере Tecan infinite M200 pro ("Tecan", Швейцария), используя набор реактивов для энзимати-ческого определения D- и L-молочной кислоты ("R-Biopharm", Германия). Энантиомерный избыток ee (%) находили по формуле:
ee = 100(Xs - Xr)/X + XR), где: XS , XR - доли энантиомеров.
За единицу удельной активности амидазы (Е) принимали количество карбоновой кислоты (ммоль), образуемой за 1 ч, в расчете на 1 г высушенных клеток (ммоль/г • ч).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Адгезия клеток R. erythropolis 11—2 на березовом активном угле БАУ. Клетки R. erythropolis 11-2 были адгезированы на БАУ и угле-сырце (рис. 1). В процессе адгезии основную роль играют гидрофобные взаимодействия между углеродом адсорбента и поверхностью клеток родококков, позво-
мг/г
0 0.5 1.0 1.5 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.