ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 536-543
УДК 547.92:579.6.66
ТРАНСФОРМАЦИЯ АНДРОСТЕНДИОНА И АНДРОСТАДИЕНДИОНА БАКТЕРИЯМИ, ДЕГРАДИРУЮЩИМИ СТЕРИНЫ
© 2004 г. Н. Е. Войшвилло, В. А. Андрюшина, Т. С. Савинова, Т. С. Стыценко
Центр "Биоинженерия" РАН, 117312 Москва; e-mail: voishvillo@rambler.ru Поступила в редакцию 28.10.2003 г.
Изучен состав стероидных метаболитов, образующихся при трансформации андростендиона и анд-ростадиендиона - продуктов микробиологического расщепления боковой цепи стеринов - почвенными и мутантным штаммами бактерий Mycobacterium и Protaminobacter. Установлено, что среди продуктов трансформации отсутствует тестололактон. Его отсутствие свидетельствует в пользу предположения о различных путях расщепления стероидного кольца D бактериями и грибами. При трансформации андростендиона почвенными штаммами выделены в очень незначительном количестве два новых 14а-гидроксипродукта с расщепленным кольцом В. Показано, что мутантный штамм Mycobacterium smegmatis, также как дикие штаммы, способен к 14а-гидроксилированию стероидной молекулы. Предполагается, что расщепление стероидного ядра со стороны колец D и С начинается с введения 14а-гидроксигруппы и последующей дегидратации.
Способность многих видов микроорганизмов использовать стероиды в качестве единственного источника углерода и расщеплять их до углекислого газа и воды, хорошо известна [1]. В работе Арима с соавт. [2] исследована способность 1589 штаммов к расщеплению холестерина и показано, что полное расщепление его молекулы осуществляют культуры Arthrobacter, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter и др. Бактерии, частично или полностью расщепляющие стероиды, часто выделяют из почв, загрязненных нефтепродуктами [3, 4]. При изучении механизма расщепления стеринов и стероидов ряда андростана и прегнана бактерией Mycobacterium smegmatis, установлено, что деградация стероидной молекулы начинается с расщепления кольца В - следствия одновременного введения в стероидную структуру 1,2-двойной связи и 9а-гидроксигруппы [1, 5-10] (рис. 1). При трансформации микобактериями холестерина (I), либо его 3-кетопроизводных (холе-стенона (II) или холестадиенона (III)) были выделены соединения с раскрытым кольцом В (секо-фенолы IV и V), рис. 1 [5-10]. Расщепления кольца В удается избежать, если использовать в процессе трансформации стероидов ингибиторы 1,2-дегидрогеназы или 9а-гидроксилазы, либо работать с мутантными штаммами, у которых блокирован синтез указанных ферментов [1]. С помощью мутантных штаммов почвенных микобак-терий из стеринов получают 17-кетостероиды (рис. 1) - андростендион (АД), андростадиендион (АДД), 9а-гидроксиандростендион (9а-ОН-АД), которые являются ключевыми соединениями в
синтезе многих стероидных медицинских препаратов.
В процессе работы со штаммом Mycobacterium smegmatis, у которого блокирован синтез 1,2-деги-дрогеназы и 9а-гидроксилазы, нами было установлено, что в определенных условиях конечный продукт трансформации стеринов - АД может полностью исчезать из культуральной жидкости [11, 12].
Поскольку указанный мутант не способен к расщеплению молекулы стероида со стороны колец А и В, логично предположить, что деградация АД происходит со стороны колец D и С (рис. 1). Так как начальные стадии этого процесса практически не изучены [1, 8], то представляло интерес выяснить, какие трансформации в кольцах С и D 17-кетостероидов предшествуют их расщеплению.
Цель работы - изучение состава стероидных метаболитов, образующихся при трансформации АД и АДД - продуктов микробиологического расщепления боковой цепи стеринов мутантными штаммами микобактерий.
МЕТОДИКА
Культуры почвенных бактерий Mycobacterium 3AP, Mycobacterium 12P, Mycobacterium paraffini-cum 134, Protaminobacter alboflavum, Rhodococcus sp., фикомицета Curvularia lunata из коллекции Центра "Биоинженерия" РАН и мутантного штамма Mycobacterium smegmatis БКПМ Ас-1552 поддерживали на скошенном агаре в условиях, описанных ранее [11-16]. Для проведения трансформации с помощью микобактерий клетки в
О'
СИзР
АД
О
СИ^О
О
АДД
си^О
О
9а-гидрокси-АД
Мутантные штаммы
Я
н
ИзС
ЫусоЪасХепиш Бшв^шайз [5-8]
О
Я
ИзС,,,
ИзС '
О
ИООС
СИз „О
СИ^о
ИзС I И
Ыр
О И
ИО
Я
СИз
IV ИО
СИз ,О
V
Рис. 1. Схема частичного расщепления стеринов бактериями. I - Я = Н - холестерин; Я = СН3 - кампестерин; Я = С2Н5 - ситостерин; II - Я = Н - холестенон; Я = СН3 - кампестенон; Я = С2Н5 - ситостенон; III - Я = Н - холеста-диенон; Я = СН3 - кампестадиенон; Я = С2Н5 - ситостадиенон.
I
O
CИ3/OИ
^C I И
VII
ШзР
c^P
cи3pи
O
O
O
АДД
АД
Mycobacterium spv Protaminobacter
C^JO
HO
HO
O
VIII
IX
c^O
Из^ I И И|ии
X
VI
Hизшиe Tpnöbi [1]
CИз
O. ^O
O
XI
^C CH
иoч
^C' 'ГИз
O
H XII
COOH
Рис. 2. Пpoмeжyтoчныe пpoдyкты тpaнcфopмaции АД и АДД earnepMiffl и гpибaми.
вoзpacтe 7-10 cyт cмывaли c пoвepxнocти aгapa и пepeнocили в жидкую cpeдy 1 cлeдyющeгo cocra-Ba (г/л ): глицepин - 20.0; кpaxмaл - 5.0; лимoннaя киcлoтa - 2.0; мoчeвинa - 0.5; xoлecтepин - 1.0; дpoж■ жeвoй экcтpaкт - 0.3; дигидpoфocфaт кaлия - 0.7 гидpoфocфaт нaтpия - 0.S; xлopид aммoния - 0.7 cyльфaт мaгния - 0.2; cyльфaт жeлeзa (II) - 0.05 pH 6.S-7.2. Kyльтypы выpaщивaли в 50 мл cpeды в кoлбax Эpлeнмeйepa oбъeмoм 250 мл в тeчeниe 3 cyт пpи 30°С пpи пepeмeшивaнии нa кaчaлкe (220 oö/мин).
Пoceвнoй мaтepиaл пepeнocили в cpeдy, coдep-жaщyю (г/л): гидpoфocфaт нaтpия - 4.5; гидpoфo-cфaт кaлия - 1.0; глюкoзa - 1.0, кyкypyзный эте-тpaкт - 15.0. Oднoвpeмeннo c пoceвным мaтepиa-лoм дoбaвляли cтepoид - АД или АДД (0.5-2.5 г/л cpeды) в видe pacтвopa в мeтaнoлe. Пpи дoбaвлe-нии АД в кoличecтвe 5.0 г/л cтepoид измeльчaли c пoмoщью yльтpaзвyкa. Инкyбaцию пpoдoлжaли в тeчeниe 1-3 cyт в зaвиcимocти oт штaммa и толи-чecтвa cтepoиднoгo cyбcтpaтa. Coдepжaниe АД
или АДД и пpoдyктoв их тpaнcфopмaции в куль-тypaльнoй жидкocти oцeнивaли кaчecтвeннo и то-личecтвeннo, иcпoльзyя мeтoды TCX и ВЭЖХ [17]. Tpaнcфopмaцию АД c пoмoщью Rhodococcus sp. и C. lunata, a тaкжe aнaлиз пpoдyктoв peaкции, ocyщecтвляли в cooтвeтcтвии c мeтoдикaми, пpи-вeдeнными в paбoтax [15, 16].
Xpoмaтoгpaфичecкий aнaлиз coeдинeний VI-X фиа 2) пpoвoдили нa плacтинкax "Silufol UV2-54" (Чexия) в ^CT^e xлopoфopм-aцeтoн-циклoгeк-caн (6 : 3 : 1). ^cne пpocмoтpa xpoмaтoгpaмм в УФ-cвeтe пpoвoдили пpoявлeниe 1%-ным pacтвopoм вaнилинa в 10%-нoм pacraope xлopнoй RMcra™.
Tpaнcфopмaцию xoлecтepинa (99% чистоты) ocyщecтвляли пpи 2S°C та cpeдe 1, нo пpи coдepжa-нии измeльчeннoгo cтepoидa дo 20 г/л, pH 7.0-7.2. Cpeдy paзливaли пo l00 мл в кoничecкиe кoлбы вмecтимocтью 750 мл. Измeльчeниe кpиcтaллoв xoлecтepинa пpoвoдили в шapoвoй мeльницe (cyc-пeнзия coдepжaлa 0.5% твита-80) в тeчeниe 5-20 ч.
+
pH 9.0
Рис. 3. Кристаллы андростендиона в реакционной смеси. Увеличение в 800 раз.
АД, г/л 12
8
4
0 12
7.0
100
200
Продукты трансформации холестерина выделяли из биомассы экстракцией водным ацетоном [11].
Извлечение продуктов трансформации АД и АДД осуществляли экстракцией ферментационной жидкости хлористым метиленом. Последующей обработкой полученного экстракта активированным углем и упариванием растворителя досуха получали сухой остаток, в котором определяли содержание стероидных компонентов с помощью методов ТСХ и ВЭЖХ.
Для разделения смеси веществ использовали хроматографию на колонке с 10-кратным количеством силикагеля "Chemapol", Чехия (40 х 100 мкм) по отношению к массе сухого остатка. Продукты трансформации элюировали хлористым метиленом, растворитель упаривали до прекращения погона.
Спектры 1Н-ЯМР соединений снимали на спектрометре "Bruker DRX 500" (США) с рабочей частотой 500 МГц в растворе дейтерохлороформа. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан.
ИК-спектры снимали на приборе Perkin-Elmer 599 (Швеция) запрессованный с KBr в соотношении 1 мг вещества/200 мг KBr.
Масс-спектры получены на приборе MAT-112 ("Varian", США) при ионизирующем напряжении 50 эВ.
Использовали ВЭЖХ хроматографическую систему "Waters 600" (США), снабженную инжектором, УФ-детектором с переменной длиной вол-
Рис. 4. Накопление АД в процессе трансформации холестерина с культурой M. smegmatis: а - размер частиц не более 10 мкм; б - размер частиц до 200 мкм. 1 — рН; 2 - концентрация АД.
ны, блоком термостатирования колонки, компьютером, и колонку "Диасорб С16Т" 3.9 х 300 мм, размер частиц 6 мкм ("Элсико", Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение условий превращения холестерина в АД с помощью Mycobacterium smegmatis показало, что при использовании для трансформации кристаллов стерина в виде частиц размером не более 10 мкм (в количестве 20 г/л среды) в куль-туральной жидкости за 240 ч инкубации накапливалось до 12 г/л продукта отщепления боковой цепи I - АД (конверсия 80%). Наблюдалось образование кристаллов АД необычной формы (рис. 3), размер которых к концу процесса мог достигать более 200 мкм. В таком процессе рН культуральной жидкости возрастал с 7.2-7.5 до 8.5-8.7 (рис. 4а). Если в суспензии I доля частиц с размером 10 мкм составляла менее 40%, то образование целевого продукта трансформации - АД прекращалось через 4 сут. ферментации (конверсия не более 30%), после чего содержание АД начинало уменьшаться. В таком случае наблюдалась корреляция этого процесса с понижением значения рН от 8.3 до 7.3 (рис. 46). Понижение рН культуральной жид-
8
4
0
ч
Метаболиты, образуемые при инкубировании АД и АДД с почвенными и мутантным штаммами при различных нагрузках стероидных субстратов
Количество стероида Метаболиты**
Штамм Субст- Содержание, г/л извлечено*
рат загружено, г г % от загруженного количества АД АДД VI VII VIII IX X
Mycobacterium sp. 3 AP АД 5.0 6.0 3.18 53.0 + + - - + + -
» АД 2.5 3.0 1.05 35.0 + + - - + + -
» АДД 1.5 1.2 0.32 26.7 + + - - + + -
Mycobacterium sp. 12 P АД 2.0 0.8 0.23 28.8 + + - - + + -
» АДД 2.0 1.0 0.15 15.0 + +
M. paraffinicum АД 0.5 0.1 0.09 90.0 + +
» АДД 1.0 0.2 0.2 100.0 - +
P. alboflavum АД 1.0 0.3 0.17 56.7 + + - - + + -
» АДД 2.0 0.8 0.23 28.8 - +
M.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.