ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 6, с. 691-694
УДК 577.152.1
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ ЛАККАЗАМИ С УЧАСТИЕМ 1-ГИДРОКСИБЕНЗОТРИАЗОЛА
КАК МЕДИАТОРА
© 2007 г. А. В. Лисов*, 3. А. Пожидаева*, Е. В. Степанова**, О. В. Королёва**,
А. А. Леонтьевский*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН 142290, Пущино Московской области, e-mail: ssl206@rambler.ru **Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, Москва, 119071 Поступила в редакцию 27.12.2006 г.
Изучены реакции очищенной лакказы базидиальных грибов Cerrena unicolor и Trametes sp. с 2,4,6-три-хлорфенолом (2,4,6-ТХФ) и пентахлорфенолом (ПХФ), включая реакции с участием медиатора 1-гидроксибензотриазола. При окислении хлорфенолов лакказой без участия медиатора в качестве первичного продукта трансформации 2,4,6-ТХФ обнаружен 2,6-дихлорбензохинон (2,6-ДХБХ), ПХФ не окислялся. В присутствии медиатора были найдены продукты более глубокой трансформации 2,4,6-ТХФ и ПХФ.
Хлорфенолы широко используются в хозяйственной деятельности человека во всем мире, преимущественно в качестве биоцидов и как интер-медиаты в химическом синтезе. Высокая токсичность, устойчивость к разложению, масштабное производство и применение хлорфенолов позволили классифицировать многих из них, особенно полихлорированные фенолы, как загрязнители окружающей среды [1].
До недавнего времени при разработке биотехнологий очистки природных сред от загрязнений хлорфенолами основные надежды возлагали на бактериальные штаммы-деструкторы, способные разлагать такие загрязнители [2, 3]. Лигнинолити-ческие грибы-базидиомицеты, известные способностью к биодеструкции необычайно широкого ряда соединений, существенно уступали в этом отношении бактериям [4]. Однако обнаруженная способность базидиомицетов адаптироваться практически к любой концентрации хлорфенолов, изменила ситуацию [5].
Из числа внеклеточных лигнинолитических ферментов грибов, способных атаковать хлорфе-нолы, наибольшую привлекательность в технологическом отношении представляет лакказа (КФ 1.14.18.1), как наиболее стабильная и не требующая специальных условий для реакции (например, пероксида водорода). Кроме того, обнаруженный эффект медиаторов, усиливающих действие лакказы [6], сделал этот фермент одним из самых востребованных инструментов в биотехнологии.
Цель работы - выделение, очистка и изучение реакций лакказы лигнинолитических грибов Cerrena unicolor и Trametes sp. с наиболее устойчивы-
ми полихлорфенолами - 2,4,6-трихлорфенолом (2,4,6-ТХФ) и пентахлорфенолом (ПХФ), включая реакции с участием медиатора.
МЕТОДИКА
Материалы и реагенты. Использовали 1-гид-роксибензотриазол (1-ГБТ), 2,4,6-ТХФ и ПХФ фирмы "Fluka" (США); 2,6-дихлоргидрохинон (2,6-ДХГХ), 2,6-дихлорбензохинон (2,6-ДХБХ) и тетрахлоробензохинон - фирмы "Grayhound" (Великобритания); другие реактивы - отечественного производства марки х.ч. и о.с.ч.; ДЕАЕ-Servacel 52 фирмы "Serva" (Германия), ДЕАЕ-Sepharose CL и хроматографические колонки Mono Q и HiLoad 26/60 Superdex 200 фирмы ("Amersham Pharmacia Biotech", США).
Микроорганизмы. В работе использовали лигни-нолитические базидиомицеты Cerrena unicolor ВКМ F-3196 из коллекции ИБФМ РАН и Trametes sp., любезно предоставленный Н.В. Беловой (Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН).
Выращивание грибов и очистка фермента. Грибы выращивали на среде Кирка в течение 10 сут [7]. В качестве индуктора использовали 0.1 мМ CuSO4. Схема очистки включала анионообмен-ную хроматографию культуральной жидкости на ДЕАЕ-Servacel 52, уравновешенным 20 мМ Na-ацетатным буфером, рН 5.0 (буфер А). Элюцию проводили буфером А, содержащим 0.5 М NaCI при скорости потока 1 мл/мин. Активные фракции объединяли, диализовали против буфера А, наносили на колонку с ДЕАЕ-Sepharose CL. Элюцию лакказы осуществляли линейным градиентом 0-0.5 М NaCI в буфере А. Активные фракции
мин
Рис. 1. Окисление 2,4,6-ТХФ очищенной лакказой (2) и системой лакказа 1-ГБТ (1); а - C. unicolor, б - Tram-etes sp.
2,6-ДХБХ, % от исходной концентрации
мин
Рис. 2. Образование 2,6-ДХБХ в ходе окисления 2,4,6-ТХФ лакказой без 1-ГБТ (2) и в его присутствии (1); а - C. unicolor, б - Trametes sp.
объединяли, диализовали против буфера А, наносили на колонку Mono Q и элюировали линейным градиентом 0-0.5 М NaCI с помощью системы AKTA-FPLC ("Amersham Pharmacia Biotech", США). На заключительной стадии использовали гельфильтрацию на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 и получали электрофоретически гомогенный препарат лакказы. Очищенный фермент концентрировали ультрафильтрацией в микроконцентраторах фирмы "Sartorius" (Германия) с пределом исключения 10 кДа. Степень очистки фермента контролировали с помощью денатурирующего электрофореза по Леммли [8].
Активность лакказы определяли по скорости окисления 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин)-6-сульфоновой кислоты (АБТС). За единицу активности принимали количество фермента, образующего 1 мкмоль продукта за 1 мин.
Реакция лакказы с полихлорированными фенолами и идентификация продуктов. Реакцию проводили при 30°С в 20 мМ Na-тартратном буфере, рН 5.0, содержащем 20% этанола и 2 мМ 2,4,6-ТХФ, или 40% этанола и 2 мМ ПХФ. Объем реакционной смеси 1 мл, количество фермента -25 Ед.
Хлорфенолы и продукты реакции с лакказой разделяли с помощью ВЭЖХ (хроматограф "LKB", Швеция), на колонке Nova-Pak C18 (3.9 х
х 150 мм, "Waters", США) в линейном градиенте 1%-ная уксусная кислота - метанол, 0-60% метанола за 6 мин при скорости потока 1 мл/мин. 2,6-ДХБХ и ТХБХ определяли по времени удерживания для соответствующих стандартов. Для идентификации разделяемых соединений, элюаты ВЭЖХ собирали и определяли методом масс-спектромет-рии на приборе Finnigan Mat 8430 (Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
2,4,6-ТХФ в концентрации 2 мМ в течение 2 ч полностью окислялся очищенной лакказой C. unicolor и Trametes sp. с образованием 2,6-ДХБХ в качестве единственного продукта реакции (рис. 1). Количество образующегося 2,6-ДХБХ возрастало по мере убыли 2,4,6-ТХФ (рис. 2). Ранее, в аналогичных реакциях лакказы из других грибов с 2,4,6-ТХФ, кроме 2,6-ДХБХ мы обнаруживали также 2,6-дихлоргидрохинон и полимерные соединения [9, 10]. Однако в этих работах не проводили изучение кинетики накопления продуктов в начальное время реакции. Кроме того, дополнительные продукты определяли не в ходе реакций непосредственного превращения хлорфенолов, а через 1 сут после их завершения. Поэтому образование продуктов, отличных от 2,6-ДХБХ, могло происходить в результате химических превращений.
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ ФЕНОЛОВ ЛАККАЗАМИ
693
Рис. 3. Накопление продуктов реакции лакказы с 2,4,6-ТХФ в присутствии 1-ГБТ. Время удерживания, мин: 1 - 8.06, 2 - 8.65, 3 - 10.66; а - C. unicolor, б - Trametes sp.
В присутствии 1-ГБТ 2,4,6-ТХФ окислялся очищенной лакказой медленнее, чем в его отсутствие (рис. 1). Это могло быть следствием конкуренции этих соединений при связывании в активном сайте фермента (и 1-ГБТ, и 2,4,6-ТХФ являются субстратами). Кроме того, известна способность 1-ГБТ ингибировать лакказу при длительном контакте с ферментом [11]. В ходе реакции с участием 1-ГБТ также обнаруживали образование 2,6-ДХБХ. В этом случае накопление 2,6-ДХБХ достигало максимума, после чего его концентрация снижалась (рис. 2). Это указывает на последующую трансформацию 2,6-ДХБХ. Кроме 2,6-ДХБХ были найдены еще три продукта трансформации 2,4,6-ТХФ со временем удерживания в указанных условиях - 8.06, 8.65 и 10.66 мин, однако из-за низкой концентрации вновь образуемых продуктов выделить и идентифицировать их не удалось. Образование двух из них наблюдалось сразу после начала реакции, в то время как продукт реакции со временем удерживания 8.6 регистрировался только через 50 мин реакции (рис. 3).
ПХФ не окислялся лакказой обоих грибов в течение трех часов реакции без 1-ГБТ (рис. 4). Это согласуется с прежними данными, которые показывают, что ПХФ является трудноокисляе-мым субстратом для лакказы [12] (известно, что
Рис. 4. Окисление ПХФ лакказой без 1-ГБТ (1) и в его присутствии (2); а - C. unicolor, б - Trametes sp.
значение Км при окислении ПХФ другими лакка-зами составляет примерно 3 мМ, что значительно выше значений для других фенольных субстратов лакказ [13]). В качестве продуктов окисления ПХФ лаказой других грибов описаны ТХБХ и полимерные соединения [13]. В присутствии 1-ГБТ ПХФ окислялся лакказой C. unicolor или Trametes sp. Содержание ПХФ снижалось в течение 3 ч на 85 и 60% соответственно (рис. 4). Образования ТХБХ не наблюдалось, но обнаруживались другие продукты со временем удерживания 10.37, 10.77 и 11.48 мин. Методом масс-спектрометрии было установлено, что продукты со временем удерживания 10.37 и 10.77 являлись коньюгатами продуктов разложения двух молекул ПХФ, содержащими пять молекул хлора на два ароматических кольца. Это указывает на то, что происходило дополнительное дегалогенирование молекул ПХФ в ходе окисления лакказой с участием 1-ГБТ. Таким образом, в присутствии 1-ГБТ происходило быстрое окисление ПХФ и его глубокая трансформация с образованием нескольких продуктов реакции.
Полученные результаты трансформации по-лихлорированных фенолов лакказой грибов указывают на возможность использования лакказы, а также систем лакказа/медиатор в качестве агентов первичной атаки при разработке технологи-
ческих приемов очистки природных сред, загрязненных хлорфенолами.
Работа выполнена при финансовой поддержке федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы Российского Федерального агентства по науке и инновациям (государственный контракт № 02.467.11.3007 от 3 мая 2005 г.).
Работа выполнена на базе ЦКП "Прикладные биотехнологии" Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Sitting M. Handbook of Toxic and Hazardous Chemicals. N. Y.: Park Ridje, 1981. 270 p.
2. O'Reilly K.T, CrawfordR.L. // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. № 9. P. 2113-2118.
3. Golovleva LA, Zaborina O.E., Arinbasarova A.Y. // Appl. Microbiol. Biotec
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.