ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 1, с. 5-18
УДК 579.222.4:579.66
ТРАНСФОРМАЦИЯ СТЕРОИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ (ОБЗОР)
© 2007 г. М. В. Донова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл., 142290;
e-mail: donova@ibpm .pushchino.ru
Поступила в редакцию 15.09.2005 г.
Современное развитие фармацевтической промышленности нацелено на широкое внедрение биотехнологических процессов и замену ими многостадийных химических синтезов. Актинобактерии являются эффективными биокатализаторами многих процессов биоконверсии стероидов, имеющих важное значение для синтеза фармацевтических гормональных препаратов. Биокаталитический потенциал этих микроорганизмов в отношении широкого ряда стероидных субстратов позволяет прогнозировать их эффективное использование для создания новых технологий получения стероидных фармсубстанций. В обзоре впервые систематизированы данные о биокаталитических возможностях актинобактерий в отношении различных реакций трансформации стероидов, таких, как гидроксилирование, введение и восстановление двойной связи, окисление стероидных спиртов, восстановление кетонов, деэтерификация и деградация боковой цепи и др. Особое внимание уделено процессам, имеющим практическое значение для биотехнологии, и прогрессу, достигнутому в области биоконверсии стероидов, за последнее десятилетие.
Стероиды занимают важное место среди лекарственных препаратов, применяемых для лечения и профилактики различных групп заболеваний в эндокринологии, онкологии, ревматологии, гинекологии и др. Номенклатура эффективных стероидных лекарств достаточно широка и постоянно расширяется. При этом ряд препаратов, применяемых в том числе по жизненно важным показаниям, не имеет нестероидных аналогов.
Промышленное производство стероидных лекарственных препаратов и гормонов основано на сочетании микробных технологий и химического синтеза [1]. Как правило, для биотехнологического производства используют целые клетки, поскольку их применение более экономично в сравнении с ферментами с учетом процедур выделения, очистки и стабилизации последних [2]. Среди наиболее эффективных биокатализаторов процессов трансформации стероидов важное место занимают актинобактерии.
Актинобактерии способны осуществлять различные трансформации стероидных соединений -дегидрирование, окисление стероидных спиртов (3р-ОН —- 3С=0, 17р-ОН —- 17С=0 и др.), изомеризацию двойной связи (А5 —► А4), гидрирование двойной связи (например, А1, А4), восстановление стероидных кетонов (17С=0 —► 17^-0Н, 20С=0 —► 20Р-0И и др.), дезацетилирование (21-О-Ас —► 21-ОН и др.), гидроксилирование (в положениях 9а, 6в, 11(а/в), 14а, 16а и др.), а так-
же полную (до С02 и воды) или частичную деградацию боковой цепи стеринов, холановых кислот, стероидов ряда прегнана и другие реакции [3-11].
ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ
Актинобактерии способны осуществлять введение гидроксильной группы в различные положения стероидного ядра (рис. 1). Гидроксилирование в положении 9а проводят представители родов Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium [12-15] (табл.1). Кетостероид-9-гид-роксилаза (9-КСГ) актинобактерий мало изучена, что связывают с трудностями ее выделения и очистки. Трехкомпонентный фермент 9-КСГ, состоящий из флавопротеинредуктазы и двух бел-
Рис. 1. Положения стероидной молекулы, в которые актинобактерии вводят гидроксильную группу. Обозначения: =0, -0Н; Я2: =0, -0Н, -СН20СН3, боковые цепи холевых кислот и стеринов; Б^: -0Н, -Н.
Таблица 1. 9а-Гидроксилирование стероидных соединений актинобактериями
Субстрат MnKpoopraHH3M Продукт Ссылка
Андрост-4-ен-3,17-дион (АД) Corynebacterium equi 9-ОН-АД [16]
АД Corynespora casticola 9-ОН-АД [17]
АД Rhodococcus sp. 9-ОН-АД [14, 15, 18]
6ß-фтор-xолест-4-ен-3-он Mycobacterium fortuitum 6ß-фтор-9-ОН-АД [19]
5а-андростан-3,17-дион Corynebacterium simplex а) 9а-гидрокси-5а-андростан-3,17-дион б) 9а-гидрокси-5а-андрост-11-ен-3,17-дион в) 9а,17а-дигидрокси-5а-андростан-3-он г) 9а,17ß-дигидрокси-5а-aндростaн-3-он [20]
3-оксипрегна-4,17(20)-диен-20-карбоксильная кислота Corynebacterium equi а) 9а-гидрокси-3-оксипрегна-4,17(20)-ди-ен-20-карбоксильная кислота б) 9а-гидрокси-3-оксипрегна-4,17(20)-ди-ен-20-карбоксильная кислота, метиловый эфир [21]
Метил-3-оксипрегна- 4,17(20)-диен-20-карбокси- лат Rhodococcus equi 9а-гидроксиметил-3-оксипрегна-4,17(20)-диен-20-карбоксилат [22]
20а -гидрокси-метилпрегн-4-ен-3-он Rhodococcus equi 9а,20а-гидрокси-метилпрегн-4-ен-3-он [23]
17а,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20-дион Rhodococcus equi 9а,17а,21-тригидрокси-прегн-4-ен-3,20-ди-он [5]
3ß-гидрокси-5а-Н-прегнa-ны Rhodococcus spp. 9а-гидрокси-4-ен-3-кето производные [24]
Холестерин Mycobacterium parafortuitum 9-ОН-АД [25]
Ситостерин Mycobacterium fortuitum а) 9а,17ß-дигидрок-сиaндрост-4-ен-3-он б) 3-кетобиснорхол-4-ен-9а,22-диол в) 9а-гидрокси-3-кетобиснорхол-4-ен-22-оевая кислота, метиловый эфир г) 9а-гидрокси-3-кетобиснорхол-4-ен-22-оевая кислота [26]
Ситостерин Mycobacterium parafortuitum а) 9-ОН-АД б) 9а-гидрокси-3-окси-23,24-биснорхол-4-ен-22-оевая кислота в) 9а-гидрокси-3-окси-23,24-биснорхол-4-ен-22-оевая кислота, эфир г) 9а-гидрокси-3-окси-24,24-биснорхол-4-ен-22-ол [27]
Ситостерин Mycobacterium fortuitum 9а-гидроксипрегна-4,17(20)-диен-3-он-20-карбоксильная кислота [28]
Ситостерин Mycobacterium fortuitum 9а-гидроксипрегна-4,17(20)-диен-3-он-20-карбоксильная кислота [29]
Холестерин M. vaccae 9-ОН-АД [6]
Смесь ситостерина, кампе-стерина и стигмастерина Mycobacterium fortuitum 9-ОН-АД [31, 32]
ков ферредоксина был выделен из Nocardia 8р. М117 [33]. Для Arthrobacter oxydans 317 было показано, что 9а-гидроксилаза наряду с 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназой (3-КСД) кодируется плазми-дой [34]. Однако нуклеотидные последовательности генов, кодирующих 9-КСГ, не были описаны.
Для Rhodococcus erythropolis SQ1 показано, что 9-КСГ включает димерный компонент [2Fe-2S]
монооксигеназы типа IA, а также установлены гены - kshA и kshB, кодирующие 9-КСГ [33]. Де-леция одного из этих генов приводила к утрате способности мутантов к росту на андрост-4-ен-3,17-дионе (АД) или андроста-1,4-диен-3,17-дионе (АДД), но при этом не влияла на способность штаммов к росту на 9а-гидроксиандрост-4-ен-3,17-дионе (9-ОН-АД). Интересным результатом
представляется то, что делеция гена kshA не влияла на деградацию стерина этим штаммом; сте-рин деградировался полностью, при этом ни АД, ни АДД не накапливались в качестве интермеди-атов, что свидетельствовало о сохранении активности 9-КСГ. Делеция гена kshB, напротив, приводила к полной утрате способности штамма к деградации боковой цепи стерина; сохранялась лишь способность штамма к окислению ситостери-на до ситост-4-ен-3-она. Было высказано предположение о том, что ген kshB включен в 9а-гидроксили-рование стеринов как компонент предполагаемой 9-КСГ, либо он является частью С-26-гидрокси-лазной системы, запускающей деградацию боковой цепи ситостерина [35]. Поскольку не удавалось достигнуть селективной индукции 9а- либо 26-гидроксилазы, то предположили, что оба фермента закодированы в одном опероне [33].
Несмотря на то, что 9Р-гидроксилирование ре-тростероидов с 9в,10а-конфигурацией в литературе не описано, можно предположить, что актино-бактерии с 9-гидроксилазной активностью смогут осуществить этот процесс.
Способность актинобактерий к осуществлению 11а- и 11Р-гидроксилирования является довольно редкой. Культура Streptomyces fradiae гидроксили-ровала вещества S Рейхштейна с образованием гидрокортизона, но выход целевого продукта был невысоким - 1.5% [3]. Упоминается о возможности 11а-гидроксилирования для 5, а П^-гидрок-силирования для 3 представителей рода Streptomyces [4]. Нам удалось обнаружить ряд новых штаммов актинобактерий, способных проводить П^-гидрок-силирование кортикоидов. В настоящее время для 11а- и 11Р-гидроксилирования преимущественно используют мицелиальные грибы.
Реакция 16а-гидроксилирования интенсивно исследовалась в связи с получением триамцинолона -эффективного противовоспалительного агента. Использование актинобактерий является наиболее предпочтительным для получения 16а-гидроксисте-роидов, обладающих высокой глюкокортикоидной активностью. Способность к 16а-гидроксилирова-нию была описана для ряда стрептомицетов (Streptomyces 8рр., S. argenteolus, S. roseochromoge-nes), а также представителей Nocardia [5, 11, 36]. При этом установлено, что актинобактерии неспецифичны в отношении субстрата: наряду с прогестероном они эффективно гидроксилирова-ли в 16а-положении также тестостерон, 1-дегид-ротестолактон, дегидроэпиандростерон (ДГЭА), прегненолон, андрост-5-ен-3р,17^-диол, 3^-гид-рокси-1,3,5-эстратриен-17-он и другие соединения. Было показано, что штамм S.roseochromoge-nes содержит цитохром Р-450, который в сцепке с двумя переносчиками электронов - розеоредок-
сином и розеоредоксинредуктазой - гидроксили-ровал экзогенный прогестерон вначале в соответствующий 16а-гидроксипрогестерон, а на втором этапе - в 2р,16а-дигидроксипрогестерон [36]. Использование реконструированной белковой системы, полученной из очищенных клеточных экстрактов S. roseochromogenes, позволило авторам направленно регулировать соотношение имеющихся продуктов [37].
Лишь единичные штаммы актинобактерий с низкой активностью способны проводить гид-роксилирование в положении 1а, 2а, 12ß, 15а, 15ß, 17а, 19. Культуры Mycobacterium smegmatis ВКПМ Ac-1552 и АТСС 12549 гидроксилировали в положении 14а АД, а почвенные штаммы Mycobacterium spp. 3 AP, 12P и Protaminobacter albofla-vum - 9(10)-секостероиды [38, 39]. Среди продуктов трансформации эргоста-7,22-диен-3-ола культурой Nocardia erythropolis был обнаружен 17а-гид-роксиэргоста-7,22-диен-3-он [40]. Позиция 20 в традиционно используемых прегнанах защищена карбонильной группой и недоступна для гидрок-силирования. Способность актинобактерий к осуществлению гидроксилирования в положениях 13 и 18 неизвестна.
Обнаружение новых биологических активностей 7а-гидроксистероидов, применяемых в диагностике и терапии раковых, нейропси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.