МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 5, с. 617-622
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.66.222.4.262:628.35
ТРАНСФОРМАЦИЯ ТИОМОРФОЛИНА ГРИБОМ
BJERKANDERA ADUSTA
© 2008 г. И. Т. Ермакова*' Н. Г. Винокурова*, Н. Ф. Зеленкова*, Б. П. Баскунов*, А. А. Леонтьевский*' **
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино **Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 10.07.2007 г.
Проведен отбор базидиальных грибов - деструкторов лигнина, способных расти в присутствии производных тиоморфолина - смеси 1,4-пергидротиазинов. Отобран штамм Bjerkandera adusta ВКМ F-3477, обладающий максимальной скоростью роста в присутствии этих соединений, изучена его деструктивная способность в отношении тиоморфолина. Разработаны методы количественного анализа тиоморфолина и продуктов его деградации на основе тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Показано, что штамм B. adusta не использует тиоморфолин в качестве источника углерода, но трансформирует его в сульфоксид тиоморфолина, который накапливается в среде. Mn-пе-роксидаза, продуцируемая B. adusta в ходе трансформации тиоморфолина, не принимает непосредственного участия в его окислении.
Ключевые слова: Bjerkandera adusta, тиоморфолин, 1,4-пергидротиазины, сульфоксид тиоморфолина, трансформация.
Гетероциклические соединения класса морфо-линов, в том числе тиоморфолин (ТМ), находят широкое применение в различных областях хозяйственной деятельности и используются при производстве пестицидов, лекарственных препаратов, резины, красок, как антикоррозийные агенты в бойлерных системах [1]. Кроме того, ТМ и его производные - 1,4 пергидротиазины (ПГТ), входят в состав продуктов нейтрализации иприта, образующихся при использовании разработанной в России технологии уничтожения отравляющих веществ в результате взаимодействия этого токсиканта с мо-ноэтаноламином, входящим в состав дегазирующей смеси [2].
Широкое распространение морфолинов вызывает опасность загрязнения ими природной среды (почвы, водных источников). Наиболее эффективным подходом для решения таких экологических проблем является разработка биотехнологий, в основе которых лежит деструктивная активность микроорганизмов, приводящая к минерализации токсичных веществ или трансформации их в менее опасные соединения.
Попытки найти микроорганизмы-деструкторы морфолинов долгое время оставались безуспешными [3], пока из очистных сооружений заводов фирмы Monsanto (США), производителя различных биоцидов, не были выделены бактериальные штам-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: ermakova@ibpm.pushchi-no.ru).
мы, способные расти на морфолине как источнике углерода, азота и энергии. Они были отнесены к роду Mycobacterium [4]. К настоящему времени найдены и другие бактерии родов Mycobacterium, Arthro-bacter и Pseudomonas, которые осуществляют деструкцию гетероциклических соединений класса морфолинов [5, 6].
Путь деградации морфолина достаточно подробно изучен у микобактерий. Начальной реакцией является разрыв C-N связи, что приводит к образованию аминокислоты, которая далее дезаминиру-ется и превращается в гликолевую кислоту. В случае ТМ сначала происходит окисление атома серы с образованием сульфоксида ТМ, а затем, после разрыва C-N связи и дезаминирования, образуется тиодигликолевая кислота (ТДГК), которая далее вовлекается в метаболизм клетки. Предполагается, что у этих организмов в превращении морфолинов участвует цитохром P450 [7].
Описан путь разрыва C-S связи у полициклического ароматического соединения дибензотиофена. Начальным этапом микробной атаки молекулы дибензотиофена является окисление атома серы ферментом дибензотиофеноксигеназой с последовательным образованием сульфоксида, сульфона и 2-гидроксибифенил-2-сульфината. Разрыв C-S связи происходит при помощи 2-гидроксибифенил-2-сульфинатлиазы с элиминированием атома серы в виде сульфат иона и образованием 2-гидрокси-бифенила у Rhodococcus rhodochrous и Gordona aichiensis [8] или бензоата у Brevibacterium sp. [9].
В качестве эффективных деструкторов устойчивых соединений хорошо известны лигнинолити-ческие грибы-базидиомицеты. Как правило, разложение различных ксенобиотиков этими грибами происходит в результате экспрессии внеклеточных лигнинолитических ферментов, сочетающих высокий редокс-потенциал с широкой субстратной специфичностью. Вместе с тем, устойчивые соединения отдельных классов могут разлагаться лигнинолити-ческими грибами без участия лигнинолитической ферментной системы [10].
Иприт и его производные, включая тиодигли-коль, как один из продуктов нейтрализации иприта, сравнительно легко разлагаются лигнинолитиче-скими грибами [11, 12]. На примере лигнинолитиче-ского гриба Coriolus versicolor изучено разложение гетероциклических серосодержащих производных тиофена, а также трансформация бензотиофена и его производных с образованием водорастворимых сульфоксидов [13]. Сообщений об участии лигнинолитических грибов в трансформации ТМ или ПГТ нет.
Целью данного исследования было выявление у лигнинолитических грибов способности к деградации тиоморфолина, идентификация промежуточных продуктов его деструкции и отработка аналитических методов определения субстрата и образующихся метаболитов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы грибов-базидиомицетов Cerena unicolor F-3196, Agaricus arvensis F-1589, Flammulina velutipes F-1996, Coprinus comatus F-2940, Fomes fomentarius F-3203, Kuehneromyces mutabilis F-3215, Pleurotus os-treatus F-3468, Daedalea quercina F-1655, Ganoderma lucidum F-1720, Bjerkandera adusta F-3477, Acremoni-um arxii F-2717 и Armillaria mellea F-1163 были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН).
Предварительный отбор штаммов, устойчивых к морфолинам, проводили по скорости роста в чашках Петри на глюкозо-картофельном агаре (ГКА), содержащем модельную смесь, имитирующую состав реакционных масс нейтрализации иприта (0.15% ПГТ, 0.25% моноэтаноламина и 0.025% эти-ленгликоля) [2] с разведением 1 : 100. В составе ПГТ было 20% ^(2-гидроксиэтил)тиоморфолина, 57% ^(2-гидроксиэтил)-2-метилтиоморфолина, 4% ^(2-гидроксиэтил)-2.6-диметилтиоморфолина, 12% ^(2-гидроксиэтил)-3-метилтиоморфолина, 7% ^(2-гидроксиэтил)-2,5-диметилтиоморфолина [14].
Изучение динамики активности лигнинолитических ферментов у грибов D. quercina, G. lucidum и B. adusta проводили при культивировании грибов на модифицированной среде Кирка [15], содержащей 1% глюкозы в качестве источника углерода, 0.05%
Твин-80, рН 5.0 с высокой (9.0 г/л аспарагина и 4.8 г/л nH4NO3) или низкой (0.9 г/л аспарагина и 0.48 г/л NH4NO3) концентрацией источников азота. Кроме того, использовали среду ГД: минеральные компоненты и микроэлементы среды Кирка, 1% глюкозы, 0.02% дрожжевого экстракта, 0.045 г/л MnSO4 в 20 мМ фталатном буфере, рН 4.5; и среду ГДП: среда ГД с 0.5 % пептона.
Изучение прироста биомассы, потребление ТМ и накопление продуктов его деструкции проводили при культивировании B. adusta на модифицированной среде Кирка с "высоким" азотом. В качестве индуктора Mn-пероксидазы добавляли 50 мг/л Mn (0.169 г/л MnSO4 ■ H2O). ТМ (0.1%, об/об) вносили в среду Кирка непосредственно перед посевом.
Культивирование проводили на качалке со скоростью 200 об/мин при 29°С в колбах емкостью 750 мл, содержащих 100 мл среды. Среду инокули-ровали гомогенизированным мицелием, который выращивали в течение 7 сут в аналогичных условиях на соево-глицериновой среде следующего состава (г/л): NH4NO3 - 0.2; KH2PO4 - 0.2; K2HPO4 - 0.02; MgSO4 - 0.1; пептон - 0.5; соевая мука - 0.5; глицерин - 0.4 мл.
В качестве источника углерода при культивировании грибов (ТМ) и стандартов для хроматографи-ческих методов анализа использовали коммерческие препараты, тиогликолевой кислоты (ТГК), ТДГК производства фирм "Sigma" и "Aldrich" (США).
Сульфоксид ТМ получали окислением ТМ ж-хлорнадбензойной кислотой в хлористом метилене [7]. Его структура была подтверждена результатами масс-спектрометрического анализа. Масс-спектры регистрировали на тандемном масс-спектрометре LCQ Advantage MAX ("ThermoFinnigan", Германия), используя одноканальный шприцевой насос для прямой инфузии образца.
Биомассу гриба определяли весовым методом.
Активность Mn-пероксидазы измеряли методом Н202-зависимого окисления Mn2+ с образованием комплекса М^+Умалонат [16], активность лакказы -по скорости окисления 2',2'-азино-бмс-(3-этил-бензотиазолин)-6-сульфоновой кислоты (ABTS) при 436 нм [17], активность лигнин-пероксидазы - по скорости окисления вератрового спирта [18].
Идентификацию продуктов трансформации ТМ проводили методами тонкослойной хроматографии (ТСХ).
Количественный анализ ТМ и сульфоксида ТМ осуществляли методом обращенно-фазной жидкостной хроматографии (ЖХ) на хроматографе высокого давления, оборудованном УФ-детектором с переменной длиной волны и интегратором "LKB-Pribori A" (Швеция). В работе использовали колонку Symmetry 300™ C4, 150 х 3.9 мм ("Waters", США). Рабочая длина волны 206 нм, температура анализа комнатная, расход элюента: (метанол-во-да-25% аммиак - 2 : 98 : 0.036) составлял
Таблица 1. Рост грибов на агаризованной среде в присутствии ПГТ (см)*
Штамм ГКА (контроль) ГКА + смесь ПГТ Штамм ГКА (контроль) ГКА + смесь ПГТ
A. arxii 3.5 0.5 D. quercina 10.0 10.0
A. arvensis 10.0 Н.р.** F. velutipes 10.0 0.1
A. mellea 0.5 0.1 F. fomentarius 10.0 Н.р.
B. adusta 10.0 10.0 G. lucidum 10.0 10.0
C. unicolor 10.0 3.0 K. mutabilis 0.1 Н.р.
C. comatus 10.0 Н.р. P. ostreatus 10.0 2.5
* Диаметр колонии после 20 суток культивирования. ** "Н.р" - нет роста.
0.5 мл/мин. Количественный расчет проводили методом внешнего стандарта. Время удерживания сульфоксида ТМ и ТМ составляло 6.21 и 22.69 мин соответственно. Применяемая методика позволяет определять эти метаболиты в диапазоне концентраций от 30 до 1000 мкг/мл с относительной погрешностью определения (%) 15.2 (сульфоксид ТМ) и 13.5 (ТМ) при n = 5, P = 0.95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Скрининг грибов, растущих в присутствии ПГТ.
Для выявления грибов, способных к росту в средах с гетероциклически
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.