ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 1, с. 42-46
УДК 577.152.32
ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ L-АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
© 2007 г. А. А. Маркосян*, Л. А. Абелян*, М. О. Адамян**, Ж. И. Акопян*, В. А. Абелян*
*Институт микробиологии HAH Армении, Абовян, Армения, 378510; e-mail: abelyan@sbc.com.my, balayan49@yandex.ru; **Биотехнологическая корпорация "Стевиан", Куала Лумпур, Малайзия, 50450
Поступила в редакцию 06.06.2005 г.
Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТаза, КФ 2.4.1.19) из мезофильных, термофильных и гало-фильных бацилл, а также мальтаза (КФ 3.2.1.20) дрожжей Saccharomyces cerevisiae использованы для трансгликозилирования аскорбиновой кислоты с крахмалом, мальтодекстрином, у-циклодекс-трином, а также мальтозой в качестве доноров гликозильных единиц. Наибольшей эффективностью обладала ЦГТаза из термофильных штаммов (степень трансгликозилирования выше 60%).
L-Аскорбиновая кислота (АК) играет важную роль в организме. В частности, она участвует в процессе гидроксилирования пролина и лизина при синтезе коллагена, всасывании железа из пищеварительного тракта, восстановлении цито-хрома C [1-2]. АК также играет важную роль в иммунной системе и обладает антиоксидантными свойствами, она участвует в заживлении ран, в восстановлении хрящей, костей и зубов [1-3].
Основным недостатком АК является быстрая потеря физиологической активности вследствие ее низкой стабильности в окислительных условиях и при сравнительно высоких температурах. Поэтому существует определенный интерес к разработке методов синтеза производных АК, обладающих высокой стабильностью и физиологической активностью. С этой целью предложены биохимические методы синтеза гликозидных производных АК, которые, однако, не обладают достаточной стабильностью при окислительных условиях [4-5].
Углеводсодержащие производные АК получены также путем химического синтеза [5]. Получены около двадцати P-D-глюкопиранозил-произ-водных АК, некоторые из которых стабильны in vitro, но не обладают достаточной физиологической активностью in vivo.
Химическим путем синтезированы также 6-О-ацил-производные 2-О-а^-глюкопиранозил^-ас-корбиновой кислоты (2Г-АК), которые, кроме стабильности in vitro и высокой активности in vivo, обладают липофильностью, и могут быть использованы в различных косметических средствах [6, 7]. 2Г-АК (рис. 1) обладает значительной стабильностью in vitro и физиологической активностью in vivo [8-14].
Синтез 2Г-АК осуществляют из смеси АК и мальтозы или других глюканов под действием а-глюкозидазы различного происхождения. В
частности, используют а-глюкозидазу из кишечной стенки различных млекопитающих, из риса и кукурузы, а также микроорганизмов (Mucor sp., Pénicillium sp., Saccharomyces sp.) [5, 15-17]. Показана возможность ее синтеза с применением бактериальной а-амилазы с использованием крахмала или мальтодекстрина в качестве доноров глю-козильных остатков [5].
Для получения 2Г-АК используется также способность циклодекстринглюканотрансферазы (1,4-а^-глюкан:1,4-а^-глюкопиранозилтрансфераза (циклизующая); ЦГТаза; КФ 2.4.1.19) из Bacillus sp. и Klebsiella sp. катализировать реакцию межмолекулярного трансгликозилирования. При этом во время синтеза 2Г-АК в качестве донора глюко-зильного остатка используют крахмал или цикло-декстрин (а-ЦД) [5, 18, 19]. Однако в настоящее время нет сравнительных данных по трансглико-зилированию АК под действием ЦГТаз различных групп микроорганизмов.
Цель работы - изучение особенностей получения 2Г-АК с применением ЦГТаз различных групп микроорганизмов, а также дрожжевых мальтаз.
HO. HO
OH
h-ÄH
«H O
H
OHoh1
H
O
(а)
O
(б)
Рис. 1. Химическая структура L-аскорбиновой кислоты (а) и 2-О-а-П-глюкопиранозил^-аскорбиновой кислоты (б).
ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ L-АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
43
МЕТОДИКА
В качестве продуцентов мальтазы использовали штаммы Saccharomyces cerevisiae St-50; St-51; St-52; St-53; St-54; St-55, а также продуценты ЦГ-Таз термофильные Bacillus stearothermophilus St-88 и St-100, мезофильные B. macerans St-39 и B. circulans St-40 и галофильный штамм B. halophi-lus St-60 из коллекции культур микроорганизмов Биотехнологической компании "Stаvian" (Малайзия).
Дрожжи выращивали в глубинных условиях на питательной среде, содержащей (%): меласса -14.0; мочевина - 0.25; (NH4)2HPO4 - 0.5 (pH 5.05.2; 29°С; 48 ч).
Продуценты ЦГТаз выращивали в следующих условиях:
B. stearothermophilus (%): крахмал - 0.7, кукурузный экстракт - 0.5, хлористый аммоний - 0.53, CaCO3 - 0.2 (pH 5.7; 56°С; 18-20 ч) [20].
B. macerans и B. circulans (%): крахмал - 1.0, кукурузный экстракт - 0.25, (NH4)2SO4 - 0.5, CaCO3 -0.2 (pH 7.0-7.5; 39°C; 48-72 ч) [21].
B. halophilus (%): крахмал - 2.0; пептон - 1.0; дрожжевой экстракт - 0.1, NaCl - 12.0; KCl - 0.2; MgSO4 ■ 7H2O - 2.0 (pH 7.0-7.2; 37°С; 24-30 ч) [22].
Определение циклизирующей активности.
2 мл 2%-ного раствора картофельного крахмала в соответствующем буфере (оптимальный рН для каждого фермента) и 0.5 мл фермента инкубировали при 50°С. Через определенные интервалы времени (0.5-1.0 мин) отбирали 600 мкл пробы и добавляли 900 мкл фенолфталеинового или бромкрезолового зеленого реагента для идентификации ß- или у-ЦД соответственно. Количество а-ЦД определяли по ВЭЖХ. За единицу активности принимали количество фермента, которое продуцировало 1 мкмоль ЦД в 1 мин [23].
Определение трансгликозилирующей активности. Реакционную смесь, содержащую испытуемый препарат ЦГТазы (4.0 ед.), 10 мг растворимого крахмала, 50 ммоль сахарозы и 10 ммоль CaCl2 в 1 мл 0.1 М буфера с оптимальным рН, инкубировали при 50°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали кипячением (10 мин), и после центрифугирования определяли количество мальто-зилфруктозы методом ВЭЖХ. За единицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль мальтозилфруктозы за 1 мин [23].
Определение мальтазной активности проводили согласно [24].
Определение АК и его гликозилированных производных. Определение проводили методом ВЭЖХ на приборе Agilent 1100 series (США) с применением колонки Zorbax SB С18 (4.6 х 150 мм) и воды с pH 2.2 (фосфорная кислота) в качестве подвижной фазы.
Скорость протока 1 мл/мин. Использовали УФ-де-тектор при 245 нм.
Биомассу отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 20 мин.
Ультрафильтрационное концентрирование ферментов осуществляли на приборе УПЛ-0.6 на колонке АР-0.2 (Россия).
В работе использовали АК производства "Basf" (Германия), глюкоамилазу производства "Novozyme" (Дания). Остальные реактивы были производства "Sigma" (США) и "Aldrich" (Швейцария).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Трансгликозилирование АК с использованием ЦГТазы. Мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом около 10, у-ЦД или растворимый крахмал в количестве 2.0 г растворяли в 5.0 мл воды, после чего добавляли АК в количестве 2.0 г и раствор выдерживали 15 мин при 45°С до полного растворения продуктов. При использовании крахмала его предварительно разжижали соответствующей ЦГТа-зой. С помощью 10%-ного NaOH pH раствора устанавливали на уровне 5.5 и добавляли 0.2 г тиомоче-вины. Вносили 200 ед. ЦГТазы, количество раствора доводили до 10.0 мл дистиллированной водой и реакцию осуществляли в течение 48 ч в темноте при 50°С и постоянном перемешивании. В случае ЦГТаз из B. stearothermophilus температура реакции была 60°С.
Среди изученных ЦГТаз наибольшей эффективностью обладают ферменты из термофильных штаммов, при которых количество продуктов трансформации достигает до 52-57%. ЦГТаза из галофильного штамма способна только незначительному трансгликозилированию. При этом для всех ферментов наиболее подходящим донором глюкозных единиц является у-ЦД (табл. 1).
Дальнейшие эксперименты проводили с ЦГТазой B. stearothermophilus St-88.
Соотношение и концентрация субстратов. Для
выявления оптимальной концентрации реакционной смеси были приготовлены 10, 20, 30, 40, 50 и 60%-ные растворы у-ЦД и АК в соотношении 1 : 1 м/м (рН 5.5) и реакцию осуществляли аналогично вышеописанному.
Выявлено, что с увеличением исходной концентрации субстратов до 50% скорость реакции существенно ускоряется и увеличивается количество продуктов трансформации. Дальнейшее увеличение приводит к некоторому снижению степени трансгликозилирования.
Массовое соотношение АК-у-ЦД 1 : 1 является оптимальным.
Таблица 1. Образование гликозилированных производных АК при помощи ЦГТаз
Источник ЦГТазы Донор Количество гликозилированных производных, % Количество 2Г-АК после обработки глюкоамилазой, %
24 ч 48 ч
B. stearothermophilus St-88 Крахмал 13.9 21.3 18.3
Мальтодекстрин 29.4 44.6 38.3
у-ЦД 42.4 57.1 48.9
B. stearothermophilus St-100 Крахмал 12.8 19.1 15.7
Мальтодекстрин 25.0 32.1 26.5
У-ЦД 33.8 52.1 45.4
B. macerans St-39 Крахмал 2.7 3.3 2.1
Мальтодекстрин 5.4 9.2 6.8
У-ЦД 7.7 12.9 8.6
B. circulans St-40 Крахмал 1.4 3.7 2.3
Мальтодекстрин 3.7 6.4 4.8
У-ЦД 4.9 8.6 6.1
B. halophilus St-60 Крахмал - 1.1 0.6
Мальтодекстрин - 1.3 0.7
У-ЦД - 1.7 1.0
Таблица 2. Влияние количества ЦГТазы B. stearothermophilus St-88 на трансгликозилирование аскорбиновой кислоты
Количество ЦГТазы, ед./г АК Степень трансгликозилирования, %
2Г-АК другие производные
50 2.5 1.5
100 10.1 12.2
200 14.4 12.8
300 22.3 10.7
400 50.2 9.2
500 53.4 9.0
700 53.2 8.1
900 51.5 8.0
1000 49.7 7.5
Влияние количества фермента. Для выявления количества вносимого фермента на эффективность процесса приготавливали 50%-ный раствор (рН 5.5) АК и у-ЦД в соотношении 1 : 1 (м/м), добавляли различные количества ферментов и реакцию осуществляли в течение 24 ч при 60°С.
С увеличением количества вносимого фермента до концентрации 500 единиц на 1 г АК наблюдалось увеличение скорости реакции и общего выхода продуктов трансформации. Дальнейшее увеличение приводит к снижению количества высокомолекулярных производных и общему снижению степени трансформации (табл. 2).
ТРАНСГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ L-ACKOPБИHOBOЙ КИСЛОТЫ
45
(а)
5б7 8
(б)
12
(в)
Ц.
(г)
2
(Д)
Рис. 2. Типичные ВЭЖХ-граммы продуктов трансгликозилирования аскорбиновой кислоты ЦГ-Тазой В. stearothermophi¡us 81-88
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.