МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 3, с. 522-525
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 571.21;579.23"315
ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ФАКТОР КАИЗО НЕ ВЗАИМОДЕЙСТВУЕТ С 5-ГИДРОКСИМЕТИЛИРОВАННЫМИ ДНК В КОНТЕКСТЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ CTGCNA
© 2013 г. С. В. Женило, О. С. Мушарова, Е. Б. Прохорчук*
Центр "Биоинженерия"Российской академии наук, Москва 117312 Поступила в редакцию 23.11.2012 г. Принята к печати 12.12.2012 г.
Ключевые слова: 5-гидроксиметилцитозин, транскрипционный фактор Каизо, метилирование ДНК.
TRANSCRIPTION FACTOR KAISO DOES NOT INTERACT WITH HYDROXYMETHYLATED DNA WITHIN CTGCNA SEQUENCE CONTEXT, by Zhenilo, O. Musharova, E. Prokhortchouk (Center "Bioengineering" Russian Academy of Sciences, Moscow, 117312, Russia; *e-mail: Prokhortchouk@biengi.ac.ru).
Keywords: 5-hydroxymethylcytosine, transcription factor Kaiso, DNA methylation. DOI: 10.7868/S0026898413030191
Метилирование ДНК — эпигенетическая модификация, одна из основных функций которой заключается в фиксировании неактивного состояния генов. У высших эукариот метилирование ДНК играет важную роль в процессах регуляции транскрипции генов во время эмбрионального развития, Х-инактивации, геномного имприн-тинга [1]. Метилирование ДНК у млекопитающих осуществляется в результате присоединения метильной группы к атому углерода в пятом положении пиримидинового кольца цитозина, в основном, в контексте CpG и катализируется ДНК-метилтрансферазами (DNMT) (рисунок а) [2]. В 2009 году в клетках Пуркинье нашли еще одно азотистое основание — 5-гидроксиметил-цитозин (5hmC) (рисунок а) — продукт окисления 5-метилцитозина (5mC) белками ТЕТ [3—5]. Исследования, направленные на определение типа клеток, для которых характерно присутствие гид-роксиметилированной ДНК, и оценка количества 5hmC в них позволили выдвинуть две гипотезы [6]. Согласно первой гипотезе, 5hmC — это эпигенетическая модификация, за интерпретацию которой отвечают те или иные белковые факторы, остающиеся пока неизвестными и способствующие формированию определенной картины хроматина со своими транскрипционными свойствами. Согласно второй гипотезе, 5hmC, наряду с 5-фор-милцитозином и 5-карбоксицитозином, является лишь промежуточным состоянием при деме-тилировании ДНК, содержащей 5mC. Поиски белковых факторов — "переводчиков" с услов-
* Эл. почта: Prokhortchouk@biengi.ac.ru
ного языка гидроксиметилирования ДНК на язык клеточных функций, позволили определить, что SRA-домен метил-ДНК-связывающе-го белка UHRF1 способен распознавать и связывать ДНК, содержащую 5hmC. Функциональная значимость этого взаимодействия пока не установлена.
В представленной работе изучена способность метил-ДНК-связывающего белка Каизо распознавать и связывать гидроксиметилированную ДНК in vitro.
Метил-ДНК-связывающий белок Каизо — транскрипционный репрессор с двумя функциональными доменами: N-концевым BTB/POZ-доменом, вовлеченным в белок-белковые взаимодействия, и С-концевым, состоящим из трех "цинковых пальцев" С2Н2-типа [9]. Домен типа "цинковые пальцы" обеспечивает его связывание с метилированными (mCpGpmCpG) и неметилированными ДНК, содержащими Каизо-связывающий сайт CTGCNA (далее КСС) [9, 10]. Для определения способности Каизо связывать гидроксиметилированную ДНК в клетках Escherichia coli UBS520BL получен рекомбинантный химерный белок, содержащий глутатион^-трансферазный домен и домен "цинковые пальцы" белка Каизо мыши, Kai-so-ZF-GST (аминокислотные остатки 344—638) (рисунок б). В качестве ДНК-субстрата в опыте по задержке в геле использовали последовательность 5-GGGCCGGAGCTGNGAGGGCAAG-GACC, которая состоит из 26 н. и содержит КСС (CTGNGA), где N в каждой цепи заменен на ци-тозин, 5mC или 5hmC (рисунок в). Все олигонук-
ки2
ки2
ои ки
Каизо
N
Л.
о
2
N
Л
о
С/С 5' СК)С(,Л 3' 3' <.1.\( СгГТ...5'
С/тС 5' СИ:С(. \ ...3'
3' 5'
С/ЪтС 5' ( ■ц;с(;л...3' 3' 5'
Ьш
тС/тС
тС/С
ИтС/С
БТБ/Р07
цитозин 5-метилцитозин 5-гидроксиметилцитозин
в
ш
5' 3'
3' 5'
ш
ш
5' 3'
3' 5'
Ьш
5' 3'
3' 5'
NLS
ИтС/ЪтС
тС/ЬтС
ИтС/тС
Ьш
5' 3'
3' 5'
Ьш ш
5' 3'
3' 5'
Ьш Ьш
5' 3'
3' 5'
ш
Kaiso-ZF-GST г
шС/шС С/С ЬшС/ЬшС ЬшС/шС шС/ЬшС
шС/С С/шС ЬшС/С С/ЬшС
Комплекс "ДНК—белок"
Свободная проба
а — Структура цитозина, 5-метилцитозина, 5-гидроксиметилцитозина. б — Схематическое изображение белка Каизо мыши. Участок белка, входящий в состав Ка180^Р-О$Т, подчеркнут. ZF — домен "цинковый палец", NLS — сигнал ядерной локализации. в — Последовательности Каизо-связывающего сайта, входящие в дуплексы для задержки ДНК-белковых комплексов в геле, содержащие 5-метилцитозин (шС), 5-гидроксиметилцитозин (ЬшС) и цитозин С в контексте СрО-динуклеотида. г — Задержка в геле ДНК-белковых комплексов дуплексов шС/шС, С/С, ЬшС/ЬшС, ЬшС/шС, шС/С, шС/ЬшС, С/шС с рекомбинантным белком Kaiso-ZF-GST (75, 150, 225, 300 нг).
ш
леотиды синтезированы в компании "Евроген". Очистку белка и опыт по задержке ДНК-белкового комплекса проводили согласно [11].
Результаты опыта по задержке комплекса ре-комбинантого белка Kaiso-ZF-GST с неметилиро-ванной пробой подтвердили способность "цинковых пальцев" белка Каизо связывать данную последовательность (рисунок г, левая панель), что согласуется с опубликованными ранее данными [10]. Замена цитозина в СрО-динуклеотиде КСС на метилированный цитозин (СТОшСОА) не повлияла на способность Kaiso-ZF-GST связывать ДНК
(рисунок г, левая панель). Однако при внесении 5ЬшС в Каизо-связывающий сайт в составе СрО-динуклеотида цинковые пальцы Каизо потеряли сродство к ДНК (рисунок г, левая панель). Таким образом, внесение гидроксиметилированного цитозина в участок связывания белка Каизо ин-гибирует его взаимодействие с ДНК.
Недавно определили распределение 5ЬшС в геноме. Оказалось, что 5ЬшС сконцентрирован: 1) в промоторах, в том числе в промоторах активно транскрибируемых генов; 2) в СрО-островках; 3) в генных районах, причем некоторые участки содер-
524
ЖЕНИЛО и др.
жат одновременно и 5mC, и 5hmC [12—14]. Более того, установлено, что гидроксиметилирование ДНК в генных участках коррелирует с экспрессией этих генов [13, 15—17]. Гены, промоторы которых содержат 5mC, чаще всего репрессированы. Однако одновременное присутствие 5hmC и 5mC в целом ряде случаев приводило к тому, что промотор становился активным [14, 15]. Данный факт может быть связан с тем, что, как известно, белки MBD-семейства (MBD1, MBD2, MBD4, MeCP2) взаимодействуют с метилированной ДНК. Внесение 5hmC в участки связывания влечет за собой полную потерю сродства этих белков к ДНК [8, 18, 19], что может приводить к нарушению установления транскрипционно неактивного состояния генов. Нам удалось показать, что присутствие 5hmC в составе Каизо-связывающих сайтов также подавляет связывание ДНК белком Каизо, что может способствовать изменению спектров белков-корепрессоров, привлекаемых к промоторам. Известно, что белок Каизо может взаимодействовать с ядерным корепрессором N-CoR, который участвует в формировании неактивного хроматина за счет деацетилазной активности белков, входящих с ним в один комплекс. Таким образом, потеря сродства Каизо к гидроксиме-тилированной ДНК может быть критичной для формирования закрытого хроматина.
Мы изучили также, как влияет присутствие 5hmC в составе одной из цепей дуплекса на связывание Каизо с ДНК. С этой целью использовали дуплексы, в которых одна цепь либо метилирована, либо неметилирована, а вторая содержит 5hmC в Каизо-связывающем сайте в составе CpG-динук-леотида. Внесение 5hmC в одну из цепей (hmC/C или C/hmC) приводит к практически полной потере сродства белка к ДНК (рисунок в, правая панель). В то же время сохраняется связывание Kaiso-ZF-GST с полуметилированной ДНК (mC/C, C/mC) и с полуметилированной/полугидрокси-метилированной ДНК (hmC/mC) (рисунок г). Таким образом, присутствие полугидроксимети-лированного дуплекса способствует ингибирова-нию связывания Каизо с ДНК, в то время как сродство белка к ДНК сохраняется лишь в случае полуметилированной/полугидроксиметилиро-ванной последовательности (hmC/mC).
В настоящее время известно, что белки ТЕТ могут переводить метилированную (mC/mC), полуметилированную (mC/C), а также полугидрок-симетилированную/метилированную (hmC/mC) ДНК в гидроксиметилированную (hmC/hmC) [4, 8]. Отметим также сравнимые величины сродства MeCP2 и MBD1 к полугидроксиметилиро-ванной/полуметилированной (hmC/mC) и метилированной ДНК [8], что, в свою очередь, может препятствовать привлечению ТЕТ-белков к ДНК и переходу 5mC в 5hmC. В данной работе нам удалось показать, что Каизо, так же как и белки
MeCP2 и MBD1, сохраняет способность связываться с полугидроксиметилированной/метили-рованной ДНК (hmC/mC), следовательно, Каизо может участвовать в регуляции уровня 5hmC.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК 11.519.11.2026).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bird A. 2002. DNA methylation patterns and epigenet-ic memory. Genes Dev. 16, 6—21.
2. Goll M.G., Bestor T.H. 2005. Eukaryotic cytosine me-thyltransferases. Annu. Rev. Biochem. 74, 481—514.
3. Kriaucionis S., Heintz N. 2009. The nuclear DNA base 5-hydroxymethyl cytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science. 324, 929—930.
4. Tahiliani M., Koh K.P., Shen Y, Pastor W.A., Banduk-wala H., Brudno Y, Agarwal S., Iyer L.M., Liu D.R., Aravind L., Rao A. 2009. Conversion of 5-methylcy-tosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935.
5. Ito S., D'Alessio A.C., Taranova O.V, Hong K., Sowers L.C., Zhang Y 2010. Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification. Nature. 466, 1129-1133.
6. Branco M.R., Ficz G., Reik W. 2012. Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nat. Rev. Genet. 13, 7-13.
7. Frauer C., Hoffmann T., Bultmann S., Casa V., Cardoso M.C., Antes I., Leonhardt H. 2011. Recognition of 5-hydroxymethylcytosine by the Uhrf1 SRA domain. PLoSOne. 6, e21306.
8. Hashimoto H., Liu Y., Upadhyay A.K., Chang Y., How-erton S.B., Vertino P.M., Zhang X.,Cheng X. 2012. Recognition and pote
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.