МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 404-410
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.14:577.114:633.11
ТРАНСМЕМБРАННАЯ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗА КОНТРОЛИРУЕТ ФАКТОРЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ ФИТОПАТОГЕНА PSEUDOMONAS SIRINGAE И МУТУАЛИСТА RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM © 2015 г. Л. А. Ломоватская1, А. С. Романенко, О. В. Рыкун
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Иркутского научного центра СО РАН
Поступила в редакцию 27.10.2014 г.
Рассматривается возможная роль трансмембранной аденилатциклазы фитопатогена Pseudomonas siringae pv. pisi и симбиотрофного микроорганизма Rhizobium leguminosarum bv. viceae в контроле активности факторов вирулентности — ферментов, деградирующих клеточную стенку растений (цел-люлазы и пектиназы). Обнаружено, что трансмембранная аденилатциклаза (АЦ) контролирует активность факторов вирулентности как фитопатогенов, так и симбионтов, однако стратегии обоих микроорганизмов, проявляемые в молекулярном диалоге с растениями с участием их аденилатцик-лазной сигнальной системы, имеют не только ряд сходств, но и принципиальных отличий.
Ключевые слова: трансмембранная аденилатциклаза, растворимая аденилатциклаза, пектиназа, цел-люлаза, фитопатогены, мутуалисты.
DOI: 10.7868/S0026365615040114
Механизмы регуляции вирулентности фито-патогенов сложны и контролируются многими факторами, в том числе их сигнальными системами [1]. Ферменты бактерий, деградирующие клеточную стенку растений, пектиназа и целлюлаза, также относятся к числу факторов вирулентности. Причем, мутуалистические бактерии, в частности, рода Rhizobium, также активно используют пектиназу и целлюлазу на ранних этапах взаимодействия с растениями [2]. По литературным данным синтез пектиназы регулируется цАМФ-зависимым рецепторным белком (CRP) [3, 4]. Таким образом, аденилатциклазная сигнальная система контролирует активность некоторых факторов вирулентности фитопатогенов. Известно, что адени-латциклазы бактериальных фитопатогенов представлены как трансмембранными формами фермента (тмАЦ), так и растворимыми (рАЦ) [5]. Однако до сих пор нет данных о роли каждой из форм АЦ в контроле факторов вирулентности бактерий.
Целью данного исследования было выявление и сравнение роли трансмембранной и растворимой форм АЦ в контроле активности пектиназы и целлюлазы, являющихся факторами вирулентности фитопатогена Pseudomonas syringae pv. pisi и мутуалиста Rhizobium leguminosarum bv. viceae.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: LidaL@sifibr.irk.ru).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В экспериментах использовали следующие виды бактерий: Rhizobium leguminosarum bv. viceae — штамм 1060, полученный из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (г. Пушкино) и Pseudomonas siringae pv. pisi, штамм 1845, полученный из ВНИИФ (р.п. Большие Вяземы, Московская обл.).
Бактериальные культуры выращивали в колбах на среде, содержащей (г/л): диализата дрожжевого экстракта — 10, глюкозы — 15, CaCO3 — 5, рН 7.0 (контрольный вариант) и в среде аналогичного состава с добавлением 50 мкМ ингибитора тмАЦ — су-рамина (опытный вариант) при температуре 25°С.
Титр бактерий определяли по стандарту мутности на планшетном спектрофотометре Immu-nochem-2100 ("High Technology Inc.", США) при длине волны 655 нм. Исследования проводили с культурами бактерий на стационарной фазе роста.
Инкубация корней проростков гороха с бактериальной культурой. Отделенные корни проростков гороха (25—35 мм) инкубировали с культурой бактерий R. leguminosarum и P. siringae в течение 6 ч. После этого инкубационную смесь фильтровали, удаляя корни, и центрифугировали, отделяя бактерии, при 16000 g. Супернатант и клетки использовали для анализа.
Приготовление образцов для анализа ферментативной активности. В супернатанте, полученном после центрифугирования, определяли активно-
сти рАЦ, целлюлазы и пектиназы. В осадок клеток бактерий добавляли среду для гомогенизации в соотношении 1 : 3 (в/об.), общий объем 4—5 мл, содержащую: 50 мМ трис-HCl рН 7.2, 0.5 мМ фе-нилметилсульфонилфторид, 0.05 мМ парахлор-меркурибензоат, 1 мМ дитиотреитол, и разрушали бактерии на ультразвуковом соникаторе "Branson Ultrasonic corp" (USA). В 2 мл бактериального гомогената определяли активности пек-тиназы и целлюлазы. Остальной гомогенат центрифугировали при 105000 g. В супернатанте определяли активность растворимой АЦ (рАЦ), а в осадке, представляющем собой мембранную фракцию, активность трансмембранной АЦ (тмАЦ), а также целлюлазы и пектиназы.
Определение уровня цАМФ в среде роста бактерий. Культуральную жидкость (КЖ), после удаления бактерий центрифугированием, кипятили и в ней определяли уровень цАМФ методом ИФА [6].
Определение активности целлюлазы и пектиназы бактерий. К 2 мл образца, содержащего исследуемые ферменты, добавляли 0.5мл 2% водного раствора карбосиметилцеллюлозы и 0.5 мл 0.2 М фосфатного буфера pH 7.0 (при определении целлюлазы, ЕС 3.2.1.4) или 2.85 мл 0.05 M трис-HCl буфера pH 8.5, 0.03 мл 0.01 М CaCl2 и 0.15 мл 1% полипектата натрия (при определении пектина-зы, ЕС 3.2.1.15). Реакцию проводили в пробирках при 27°C в течение 3 ч и останавливали добавлением 3 мл реактива для определения редуцирующих сахаров и последующим прогреванием в течение 5 мин при 100°C. Определение редуцирующих сахаров проводили с реактивом на основе сегнетовой соли на планшетном спектрофотометре Immunochem-2100 ("High Technology Inc.", США) при длине волны 670 нм [7]. Результаты выражали в мг/мл редуцирующих сахаров и при расчетах учитывали разбавление осадка бактерий.
Определение активности "растворимой" и трансмембранной форм аденилатциклазы. Реакцию инициировали внесением белка в количестве 100—150 мкг/500 мкл инкубационной среды, содержащей: 50 мМ трис-HCl, рН 7.2, 0.1 мМ тео-филлин (ингибитор фосфодиэстеразы цАМФ), 0.5 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0.05 мМ парахлормеркурибензоат, 1 мМ дитиотреитол, 0.5 мМ АТФ. В качестве кофактора для тмАЦ использовали MgSO4 (3 мМ), а для рАЦ — MnCl2 (3 мМ). Реакцию проводили при 27°С в течение 30 мин и останавливали кипячением в течение 3 мин на водяной бане. Об активности обеих форм аденилатциклазы судили по возрастанию количества цАМФ в пробе, рассчитанного на мг белка.
Очистку образцов от других циклических нук-леотидов на колонке с нейтральной окисью алюминия проводили по методу [8]. цАМФ определя-
ли иммуноферментным анализом [6]. Белок в пробе определяли методом Брэдфорд.
Статистическая обработка данных. Эксперименты проводили в трех биологических и восьми аналитических повторностях. Полученные результаты обрабатывали статистически, с вычислением ошибки среднего значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Активность трансмембранной и растворимой форм аденилатциклазы P. siringae pv.pisi. Исследования показали, что у фитопатогена P. siringae pv. pisi функционируют две формы АЦ: трансмембранная и растворимая. Причем активность рАЦ в бактериях была значительна ниже, чем тмАЦ. Кроме того, рАЦ присутствовала в КЖ, где уровень ее активности был примерно в 7 раз выше, чем в самих бактериях (табл. 1). Сурамин практически полностью ингибировал тмАЦ; при этом активность рАЦ в бактериях оставалась на уровне контроля, но сильно возрастала в КЖ бактерий. цАМФ в КЖ в контроле (без сурамина) находился в микромолярных концентрациях, но в среде с су-рамином (опыт) весьма существенно снижался (табл. 2). Это указывает на то, что синтез большей части цАМФ в КЖ осуществлялся тмАЦ.
Известно, что в максимальной степени вирулентность патогенов проявляется при контакте с растением [9, 10]. Поэтому в следующей серии экспериментов бактерии инкубировали с корнями проростков гороха (растение-хозяин) и, в отдельном эксперименте — с корнями растений картофеля in vitro (растение-нехозяин). При этом резко, более чем на порядок, повышалась активность тмАЦ бактерий и рАЦ в КЖ, тогда как активность рАЦ в клетках бактерий по-прежнему оставалась на низком уровне (табл. 1). Интересно, что в большей степени активность упомянутых форм АЦ повышалась при коинкубации фитопатогена с корнями растений картофеля in vitro. При внесении в культуры бактерий сурамина активность тмАЦ снижалась в большей степени в варианте их коинкубации с корнями проростков гороха, чем с растениями картофеля. Согласно литературным данным корневые выделения гороха содержат ряд соединений фенольной природы, в частности, ^фенил-2-нафтиламин, который ингибирует рост бактерий [11]. Логично предположить, что снижение скорости роста бактерий может быть сопряжено с изменением активности тмАЦ. В этих условиях активность рАЦ в КЖ сильно возрастала по сравнению с контролем (инкубация с корнями растений без сурамина) (табл. 1). Уровень цАМФ в КЖ бактерий при добавлении корней растений гороха и картофеля также несколько возрастал. Следует заметить, что сами по себе корни проростков гороха и картофеля секретировали цАМФ в среду роста в очень
Таблица 1. Изменение активности различных форм АЦ (цАМФ, нМ/мг белка) Pseudomonas syringae pv. pisi под влиянием сурамина (50 мкМ) и инкубации с корнями растений гороха и картофеля in vitro
Формы АЦ P. syringae pv. pisi P. syringae pv. pisi + горох P. syringae pv. pisi + картофель
контроль сурамин контроль сурамин контроль сурамин
тмАЦ 11 ± 0.4 0.005 ± 0.0002 294 ± 13 29 ± 1.1 400 ± 15 150 ± 6.3
рАЦ в клетках бактерий 0.3 ± 0.01 0.3 ± 0.02 0.1 ± 0.004 0.1 ± 0.005 0.1 ± 0.004 0.1 ± 0.004
рАЦ в КЖ 2 ± 0.1 35 ± 1.3 132 ± 5.8 330 ± 15 166 ± 7.3 700 ± 32
низкой концентрации, не превышающей десятые доли пикомолей (данные не приведены).
Повышение активности рАЦ в КЖ при инги-бировании тмАЦ, на наш взгляд, может выполнять функцию компенсаторного механизма для сохранения жизнеспособности и вирулентности данного фитопатогена.
Активности целлюлазы и пектиназы P. siringae pv. pisi. В соответствии с целью настоящего исследования были изучены целлюлитическая и пекто-литическая активности Р. зтщав. Традиционно считается, что главными действующими факторами вирулентности у этой бактерии являются сиринготоксин и некоторые эффекторные белки, вызывающие у устойчивых растений реакцию сверхчувствительности [12, 13]. В то же
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.