БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 1, с. 25-33
УДК 577.352.4
ТРАНСПОРТ КАЛИЯ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТОК
МОЗЖЕЧКА КРЫС: ВЛИЯНИЕ ПАРЦИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ КИСЛОРОДА
© 2008 г. Н. Б. Богданов1*, И. Ю. Петрушанко12, А. А. Болдырев3, М. Гассманн1,
А. Ю. Богданова1
1Ветеринарный институт Университета г. Цюрих, Цюрих, Швейцария; факс: +41 44 6358932; электронная почта: nikolaib@vetphys.uzh.ch;
2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, ул. Вавилова 32,119991 Москва, Россия;
3Международный биотехнологический центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия
Поступила в редакцию 17.07.2007 г.
Изучена зависимость активного и пассивного токов К+ через мембрану свежевыделенных гранулярных клеток мозжечка крыс от содержания кислорода в среде. Показано, что транспортная активность Na+, К+-АТР-азы имеет максимум в области, соответствующей парциальному давлению кислорода в мозжечке крыс в условиях нормоксии. Ингибирование внутриклеточной продукции NO блокатором NO-синтазы (NOS) L-NAME подавляет как активный, так и пассивный транспорт калия, но этот эффект наблюдается только при низком парциальном давлении кислорода. Внесение в среду блокатора гуанилатциклазы (ГЦ), 1И-[1,2,4]оксадиазоло[4,3-а]квиноксалин-1-один (ODQ), лишает Na+, К+-АТР-азу чувствительности к изменениям парциального давления кислорода, что позволяет предполагать, что активация Na+, К+-АТР-азы в условиях гипоксии опосредована повышением уровня сОМР. Присутствие активатора протеинкиназы G (PKG) Rp-8-CTP не повышает активности Na+, К+-АТР-азы при любом уровне кислорода в среде инкубации; это позволяет предполагать, что эффект сОМР на фермент реализуется с помощью иных сигнальных механизмов. Обнаружены различия в чувствительности изоформ №+,К+-АТР-азы к гипоксии: при нормоксии уабаин-резистентная компонента насоса обеспечивает наибольший вклад в активный транспорт ионов, тогда как в условиях жесткой гипоксии активность чувствительной к уабаину компоненты насоса становится преобладающей.
Соотношение между активным и пассивным транспортом ионов натрия и калия через плазматическую мембрану в возбудимых тканях (нейроны и кардиомиоциты) играет ключевую роль в поддержании жизнеспособности этих клеток в период гипоксического стресса [1-3]. В нейронах большинства млекопитающих, неспособных противостоять гипоксическому воздействию, снижение концентрации кислорода вызывает подавление активности Na+, К+-АТР-азы, в то время как активность натриевых и калиевых каналов остается неизменной или даже растет [2]. Деполяризация и следующая за ней диссипация трансмембранных градиентов Na+ и К+ сопровождается подавлением возбудимости и гибелью клеток посредством некроза [3]. Животные, способные переживать глубокую гипоксию, выработали стратегии, позволяющие им либо подавлять в равной мере активный и пассивный транспорт Na+ и К+ через мембраны нейронов (западная цветная черепаха, Chrysemys picta bellii), либо поддерживать активность Na+,K+-АТР-азы на "нормоксийном" уровне (карась Caras sius carassius) [2]. Выбор стратегии адаптации обусловлен активностью животных в период гипо-
ксии: животные, переживающие гипоксию в коматозном состоянии, могут значительно снизить ней-рональную активность, в то время как другие, сохраняющие подвижность в условиях пониженного содержания кислорода, вынуждены изыскивать энергетические ресурсы для поддержания стабильной работы мозга.
Механизмы, участвующие в регуляции активности нейрональной Na+, К+-АТР-азы кислородом, мало изучены [4]. Поскольку сама Na+, К+-АТР-аза не имеет участков связывания кислорода, необходимо прежде всего охарактеризовать первичный "кислородный сенсор", связывание кислорода с которым инициирует сигнальный каскад, приводящий к изменению ее активности. Данные, полученные нами и другими исследователями, позволяют предполагать, что ответ Na+, К+-АТР-азы на понижение парциального давления кислорода в среде не всегда опосредован истощением клеточного уровня АТР, но, как правило, связан со смещением редокс-статуса клетки [5-8].
Если предположить, что редокс-статус клетки участвует в регуляции активности ионных переносчиков кислородом, то для понимания природы
этой регуляции необходимо охарактеризовать генераторы активных форм кислорода и соответствующие редокс-сенсоры. Имеющиеся данные позволяют предполагать, что они обладают выраженной тканевой специфичностью. В клетках альвеолярного эпителия первичным сенсором кислорода предположительно являются митохондри-альные цитохромы, которые в условиях жесткой гипоксии (р02 = 1.5 кПа) насыщаются электронами и генерируют свободные радикалы [9]. В эритроцитах человека первичным рецептором кислорода служит мембраносвязанный гемоглобин [10], а гид-роксильный радикал и изменение редокс-статуса выступают в качестве вторичного мессенджера в цепи передачи сигнала на ионные переносчики, регулирующие клеточный объем [11-13]. В гранулярных клетках мозжечка (ГКМ) крыс одним из таких "первичных рецепторов" кислорода является NO-синтаза (NOS), хотя нельзя исключить и участия NADPH-оксидазы в рецепции кислорода [14].
Способы передачи сигнала с рецептора на ионный переносчик различаются в клетках разного типа. В клетках альвеолярного эпителия инактивация №+,К+-АТР-азы в ответ на гипоксическое воздействие происходит посредством интернали-зации фермента в клатриновых везикулах. Сигналом к последней служит активация Rho-киназы iPKC-Z [6]. Интересно, что интернализации селективно подвергается лишь а1-изоформа Na+,K+-АТР-азы, но не а2/а3-изоформы [6]. На клетках печени сурка, способного переживать длительные периоды гипоксии, показано, что недостаток кислорода приводит к активации редокс-чувствитель-ных киназ группы РКС, способных фосфорилиро-вать каталитическую а-субъединицу АТР-азы в нативной форме [5]. Na+, К+-АТР-аза ГКМ крыс также чрезвычайно чувствительна к смещению уровня восстановленного глутатиона [15].
Выяснение механизмов, стоящих за чувствительностью к кислороду процессов активного и пассивного транспорта К+ (Rb+) через мембрану ГКМ крысы, стало темой настоящей работы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс. Гранулярные клетки выделяли из мозжечка 9-10-дневных крыс Wistar, предварительно усыпленных галотаном. Извлеченную и измельченную ткань мозжечка помещали в раствор Тироде (125 мМ NaCl, 25 мМ NaHC03, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, рН 7.4), содержащий коллагена-зу ("Worthington", США, 200 ед/мл) и инкубировали 30 мин при 33°С. После инкубации с коллагеназой клетки несколько раз промывали раствором Тироде, содержащим фетальную сыворот-ку ("GIBCO", США, 150 мкл/15 мл) и суспендировали в том же
растворе. Клетки пропускали через нейлоновый фильтр (40 мкм), затем суспензию разбавляли до нужного объема и помещали на 30 мин в инкубатор (33°С, 5% CO2). Количество живых клеток в суспензии составляло не менее 55% и не уменьшалось за время эксперимента (~4 ч).
Измерение однонаправленного входа К+ в клетки. Транспортную активность Na+, К+-АТР-азы оценивали, измеряя уабаин-чувствительный однонаправленный вход в клетки К+ (86Rb+, "Perkin Elmer", США). Формировали две серии проб, содержащих суспензию клеток, которые инкубировали с газовыми смесями с различным содержанием кислорода (0.5, 1, 3, 5, 10, 21 кПа). В пробирки первой серии за 15 мин до окончания инкубации добавляли уабаин ("Sigma", США, 1 мМ). По окончании инкубации в пробы добавляли 86Rb+ и через 3, 5, 7 и 10 мин отбирали аликвоты. Клетки дважды отмывали раствором, не содержащим ионов Na+ и K+ (100 мМ Mg(NO3)2 + 10 мМ имидазол). К полученному клеточному осадку добавляли 1 мл 5% три-хлоруксусной кислоты и 5 мл дистиллированной воды и измеряли активность на сцинцилляционном счетчике.
Однонаправленный вход К+ в клетки рассчитывали из наклона кривых зависимости накопления 86Rb+ клетками от времени. Пассивный вход К+ вычисляли из наклона кривой накопления 86Rb+ в клетках, инкубированных в присутствии 1 мМ уа-баина в среде, в то время как активный (опосредованный №+,К+-АТР-азой) вход К+ рассчитывали как разность между величинами наклона двух кривых накопления радиоактивного изотопа: в присутствии и в отсутствие 1 мМ уабаина. Перед началом экспериментов по измерению транспортной активности оценивали соотношение живых и мертвых клеток в суспензии с помощью красителя трипанового синего. В дальнейшем нормирование добавляемой суспензии, которую использовали для измерения транспортной активности Na+,K+-АТР-азы, проводили на белок, содержащийся в живых клетках.
Измерение гидролитической активности Na+, К+-АТР-азы. Гидролитическую активность Na+, К+-АТР-азы измеряли по накоплению неорганического фосфата в среде инкубации по методу Ратбуна и Бетлах [16]. Клетки инкубировали в средах, уравновешенных с газовыми смесями фиксированного состава. По окончании инкубации клетки разрушали при помощи трех циклов замораживания/оттаивания. Эффективность пермеабилизации плазматической мембраны была доказана нами ранее при сравнении величин гидролитической активности проб в присутствии и в отсутствие 0.0005% сапонина. Для определения гидролитической активности составляли две серии параллельных проб, содержащих исходный раствор (130 мМ NaCl; 20 мМ KCl; 3 мМ MgCl2; 30 мМ HEPES, pH
7.4, ± уабаин), в которые добавляли суспензию разрушенных клеток и после 5 мин преинкубации при 37°С добавляли 3 мМ АТР. Спустя 7 мин реакцию останавливали стоп-раствором (1 М ацетатный буфер + 4% формальдегид, рН 4.3). К полученному раствору добавляли 2% раствор (КН4)3Мо04 и свежеприготовленный раствор SnCl2 (15 мг SnCl2, 100 мкл СН3С00Н, 5 мл Н20). Через 15 мин измеряли поглощение на спектрофотометре (к = 660 нм). Количество фосфата, образованного Na+,K+-ATP-азой, определяли как разницу между количеством фосфата в пробах в присутствии и в отсутствие уа-баина.
В опытах по изучению вклада различных изо-зимов №+,К+-АТР-азы образование неорганического фосфата определяли в ряде проб, содержащих уабаин в возрастающих концентрациях (0; 10-7; 5 х 10-6;
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.