ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.23;579.25
ТРАНСВЕРСИЯ ПОЛЯРНОСТИ КЛЕТОК ОТ БИ- К МНОГОПОЛЯРНОСТИ - ОПРЕДЕЛЯЮЩИЙ МЕХАНИЗМ
ПОЛИСПОРОГЕНЕЗА БАКТЕРИИ ШЛЕЮБЛСТЕЯ РОЬУЕМВОЗРОЯт Р8-1Т
© 2014 г. В. И. Дуда*, **, Н. Е. Сузина*, В. Н. Поливцева*, А. Б. Гафаров*, А. П. Шорохова*, А. В. Мачулин*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Московская обл.
**Пущинский государственный естественно-научный институт, Московская обл.
Поступила в редакцию 10.02.2014 г.
На количество спор, образующихся в одной клетке ЛпаегоЬаМегpolyendosporus Р$-1Т, значительное влияние оказывает состав питательной среды. В зависимости от концентрации углеводов в синтетической среде количество спор в одной клетке колеблется от одной—двух до пяти—семи. Флуоресцентно-микроскопическое и электронно-микроскопическое изучение процесса спорообразования показало, что на средах с 0.5—1.0% глюкозы или галактозы после прекращения деления большинство вегетативных клеток не изменяют своей палочковидной формы. Нуклеоиды в них локализуются на полюсах клеток вблизи от полярного сайта цитоплазматической мембраны. На одном или обоих этих полюсах происходит формирование проспор. При этом возле каждой проспоры регистрируется присутствие сателлитного нуклеоида-"оператора". В этом варианте с биполярной организацией материнских клеток происходит формирование только по одной или по две споры в одной клетке. Во втором варианте развития культур на средах с низкой концентрацией галактозы (0.1—0.3%) большинство вегетативных клеток после прекращения деления значительно увеличиваются в объеме и принимают овальную или шаровидную форму. В этих клетках с помощью эпифлу-оресцентной микроскопиии и использования специфичных для нуклеиновых кислот флуорохро-мов (ДАФИ и акридинового оранжевого) визуализируется присутствие множества нуклеоидов (от шести до девяти). При этом нуклеоиды расположены по периферии клетки в тесном контакте с ци-топлазматической мембраной. Эти нуклеоиды становятся центрами (полюсами) для формирования проспор. Таким образом, в начале стационарной фазы развития культур происходит трансверсия ("переход") от биполярности к многополярности клеток. На фоне отсутствия деления клеток и продолжающейся репликации нуклеоидов происходит формирование многоядерных особей, полинук-леоидность и мультиполярность которых является определяющим условием для осуществления эндогенного полиспорогенеза. При этом во многих овальных и шаровидных клетках наблюдается синхронное образование от трех до семи спор-близнецов.
Ключевые слова: полярность клеток, трансверсия полярности, ультраструктурная организация бактерий, нуклеоид, многоядерность (полинуклеоидность), эндогенное спорообразование, полиспо-рогенез, споры-близнецы, полиморфизм.
Б01: 10.7868/80026365614050103
Обычно у большинства бактерий при эндогенном спорообразовании в одной клетке формируется только по одной споре. Известны только два рода анаэробных бактерий, у которых описано образование нескольких (до восьми) эндоспор в одной клетке: "Metabacterium" [1, 2] иAnaerobacter [3]. В наших работах было показано, что бактерии рода Anaerobacter филогенетически и по физиологическим свойствам близки к представителям рода Clostridium [3, 4]. Результаты последних исследований не полученных в чистой культуре микроорганизмов рода "Metabacterium" выявили
1 Автор для корреспонденции (e-mail: duda@ibpm.pushchi-no.ru).
прокариотную природу этих микроорганизмов и их принадлежность к филогенетической группе Clostridia [5]. Удобным объектом для изучения полиспорогенеза является почвенная бактерия Anaerobacter, поскольку один из представителей этого рода — A. polyendosporus штамм PS-1T выделен и изучается в чистой культуре [3, 4, 6, 7]. Природа бактериального полиспорогенеза в настоящее время слабо изучена, как в плане цитологических механизмов, так и генетической регуляции этого процесса.
Настоящее исследование посвящено электронно-микроскопическому и люминесцентно-микроскопическому изучению процесса споро-
575
5*
образования A. polyendosporus PS-Í1 на средах с различным содержанием углеводов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. В исследованиях использовали штамм A. polyendosporus PS-Í1, подробно описанный в работе [3]. Бактерию выращивали на картофельном агаре (КА) и синтетической среде — жидкой (СС) и агаризованной (ССА), состав которой был ранее предложен Пфеннигом [8]. В эту среду добавляли микроэлементы по Пфеннигу и Липперту [9], дрожжевой экстракт ("Difco") — 0.05%, глюкозу либо галактозу в различной концентрации (в %): 0.1; 0.2; 0.3; 0.5; 1.0; 1.5; 2, а также тиогликолат натрия (0.1 мг/мл). Культуры в жидкой среде выращивали, используя методику Хангейта [10], а посевы на агаризованной среде инкубировали в микро-анаэростатах, заполненных очищенными от кислорода N2 (95%) и CO2 (5%).
Фазово-контрастная микроскопия. Изучение объектов в фазово-контрастном режиме проводили в световых микроскопах OPTON ICM 405 ("Zeiss", Германия) и ЛЮМАМ ("ЛОМО", Россия).
Флyоресцентная микроскопия. Для эпифлуо-ресцентной микроскопии клетки фиксировали 1.5% глютаральдегидом в течение 30 мин и окрашивали 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидро-хлоридом (ДАФИ) ("Molecular Probes, Inc.") концентрацией 1 мкг/мл в течение 5 мин. Прижизненное флyорохромирование клеток акридиновым оранжевым (АО) (5 мкг/мл) осуществляли при рН 6.0 в течение 5 мин. Препараты просматривали в микроскотх Polyvar ("Reichert", Австрия) и ЛЮМАМ ("ЛОМО", Россия) при возбуждении флyоресценции УФ-светом с максимумом в области 360 нм (для препаратов, флyорохромирован-ных ДАФИ) и синим светом (фильтр 400—490 нм — для препаратов, окрашенных АО). Применение АО имеет важное значение, поскольку обеспечивает прижизненную окраску. Так как цитоплазма-тические включения у изучаемой бактерии отсутствуют, то структуры, флyоресцирyющие зеленым светом, мы относили к нуклеоидам, проспоры же в этих условиях флyоресцирyют красным светом.
Долю многоспоровых клеток определяли путем подсчета общего числа спорулирующих клеток в культуре и отдельно дву- трех- четырех- пяти- шести- и семиспоровых особей с последующим подсчетом процента каждой из фракций этих клеток. Общее число учитываемых клеток в каждой культуре составляло 150 особей. Подсчет производился непосредственно в поле зрения микроскопа, либо на фотоотпечатках выбранных полей зрения; при этом учет общего числа клеток в культурах не производили.
Электронно-микроскопические методы исследования. Для приготовления ультратонких срезов клетки концентрировали центрифугированием
(10000 g, 15 мин) и фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 1 ч при 4°C. Затем материал трижды отмывали 0.05 М какодилатным буфером (рН 7.2) и дополнительно фиксировали 2%-ным раствором OsO4 в том же буфере в течение 4 ч при 18—20°C. Материал заключали в агар, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Срезы, полученные на ультратоме LKB 2128 ("LKB Produkter", Швеция), окрашивали 3%-ным раствором ура-нилацетата в 70% этаноле и дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [11]. Образцы просматривали в электронном микроскопе JEM 100B ("JEOE', Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Определение величины генома. Для определения размера генома использовали метод, основанный на методических принципах, описанных в работе [12] и предусматривающих применение гель-электрофореза и рестриктаз. Однако наличие большого количества полисахарида, образующегося в клетках штамма PS-1T при культивировании на всех типах питательных сред, использованных в работе, значительно затрудняло выделение препаратов ДНК, пригодных для анализов.
Поэтому для выделения ДНК мы использовали суспензии клеток, предварительно выдержанных в анаэробных условиях в безуглеводной среде СС в течение 1—2 суток при температуре 28°С.
Для рестрикции нативной хромосомной ДНК использовали ферменты фирмы "Fermentas" (Литва) согласно рекомендациям производителя. Для наиболее точного определения размера генома изучаемого штамма PS-1T в рестрикционном анализе было использовано 8 ферментов, узнающих последовательность из 6 или 8 пар нуклеотидов богатых как AT, так и GC последовательностями.
В результате проведенных исследований были отобраны три фермента Apal, ¿gsI и NotI, дающие наименьшее количество рестрикционных фрагментов, для последующего анализа генома с помощью инверсионного и пульс-электрофореза.
Нативную хромосомную ДНК, иммобилизованную в агарозу, выделяли согласно протоколу FIGE Mapper. Instruction Manual and Application Guide ("BioRad", США).
Для определения размеров фрагментов ДНК от 0.05 Mb до 0.15 Mb использовали инверсионный электрофорез на приборе FIGE Mapper ("BioRad", США). Электрофорез проводили согласно рекомендациям производителя по программе № 8: при комнатной температуре в 0.5х трис-боратном буфере в течение 20 ч при прямом напряжении 180 В и обратном 120 В, пульсы 0.4-3.5 с.
Для определения размеров фрагментов ДНК больше 0.2 Mb использовали пульс-электрофорез (PFGE) на приборе Pulsaphor System ("Pharmacia
Рис. 1. а — вегетативные клетки из 3-суточной культуры, выросшей на среде СС с 0.5% галактозы; б — спо-рулирующие клетки из 5-суточной культуры, выросшей на среде СС с 0.5% галактозы. Фазовый контраст. Обозначения: С — спора. Длина масштабной линейки — 5 мкм.
LKB", Швеция). Электрофорез проводили в 1% агарозе согласно программе № 2: при температуре 14°C в 0.5х трис-боратном буфере объемом 2.5 л в течение 24 ч при напряжении 180 В, пульсы 5—30 с.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Культуры штамма A. polyendosporus Р8-1Т, выращенные на средах КА, СС и ССА, характеризуются наличием двух морфотипов клеток — палочковидных (цилиндрических) (ПК) и крупных овальных (шаровидных) — ОК. ПК преобладают в течение всего цикла развития на указанных средах при добавлении в них 0.5—1.0% глюкозы или галактозы (рис. 1; 3; 7, 1—3); они, как правило, образуют цепочки из 2-4-х клеток. В то же время, ОК преобладают на СС и ССА при внесении в них низких конц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.