МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 218-225
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.871.8.083.18
ТРИ НОВЫХ ВИДА БРЕВИБАКТЕРИЙ - BREVIBACTERIUM ANTIQUUM SP. NOV., BREVIBACTERIUM AURANTIACUM SP. NOV. И BREVIBACTERIUM PERMENSE SP. NOV.
© 2004 г. E. Ю. Гавриш1'2'*, В. И. Краузова2, Н. В. Потехина3, С. Г. Карасев4, Е. Г. Плотникова5, О. В. Алтынцева5, Л. А. Коростелева6, Л. И. Евтушенко12
1Пущинский государственный университет 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино 3Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 4Кубанский государственный университет, Краснодар 5Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь 6Кубанский государственный аграрный университет, Краснодар Поступила в редакцию 04.03.03 г.
Проведено таксономическое изучение оранжевопигментированных бактерий, выделенных из образцов многолетнемерзлых осадков, рисовых чеков и почв, загрязненных отходами химических и соледобывающих производств, сходных с Brevibacterium linens по фенотипическим признакам, а также штаммов, ранее описанных как B. linens. Среди изученных микроорганизмов выявлено 3 ге-номовида с уровнем ДНК-сходства между их представителями и типовыми штаммами известных видов бревибактерий 24-59%. Штаммы геномовидов различались по физиолого-биохимическим характеристикам, составу сахаров и полиолов тейхоевых кислот клеточной стенки, а также дифференцировались по этим признакам от ранее описанных видов бревибактерий. Анализ нуклеотидных последовательностей 16S рДНК подтвердил принадлежность изученных организмов к роду Brevibacterium и обособленность представителей 3 геномовидов от известных видов на филогенетическом уровне. На основании полученных результатов мы предлагаем описания новых видов: Brevibacterium antiquum (типовой штамм ВКМ Ас-2118т = УКМ Ac-411T), Brevibacterium aurantiacum (типовой штамм ВКМ Ас-2111т = NCDO 739T, ATCC 9175T) и Brevibacterium permense (типовой штамм ВКМ Ас-2280т = УКМ Ac-413T).
Ключевые слова: актиномицеты, Brevibacterium, тейхоевые кислоты, 16S рДНК.
Род Brevibacterium объединяет грамположи-тельные, коринеформные бактерии, характеризующиеся пептидогликаном А1у-тииа с мезо-ди-аминопимелиновой кислотой, изопреноидными хинонами дыхательной цепи МК-8(Н2) и отсутствием миколовых кислот [1-3]. Среди компонентов полярных липидов обнаружены дифос-фатидилглицерин, фосфатидилглицерин и ди-маннозиддиацилглицерин, некоторые штаммы образуют фосфатидилинозит; среди жирных кислот доминируют антеизо- и мзо-метил разветвленные кислоты [1-3]. Клеточная стенка бревибактерий содержит глицерин-, рибит- и ман-ниттейхоевые кислоты, однако детальная структура этих полимеров не была установлена [1-6]. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 60-67 мол. %. В настоящее время род включает 9 видов: B. linens (типовой вид), B. casei, B. epidermidis, B. iodinum,
* Адресат для корреспонденций (e-mail: gavrish@ibpm.push-chino.ru).
B. mcbrellneri, B. otitidis, B. avium и B. paucivorans [2, 3, 7-11].
Штаммы видов B. casei, B. iodinum и B. linens обычно выделяются из молока, сыров, причем B. linens является одним из основных компонентов микрофлоры разных сортов сыра. B. epidermidis - типичный представитель микрофлоры кожи человека; штаммы видов B. mcbrellneri, B. otitidis, B. paucivorans, B. lutescens, а также B. casei и B. epidermidis обнаружены в клинических образцах [1, 7, 9-11].
Из всех описанных видов только штаммы B. linens характеризуются оранжевой пигментацией колоний, в связи с чем все оранжевоокра-шенные бактерии рода причислялись к этому виду. Неоднократно отмечалась генетическая и фе-нотипическая гетерогенность B. linens [1, 5, 12]. В частности, было показано, что этот вид содержит минимум два геномовида, однако реклассифика-ция штаммов не была произведена [5].
В ходе изучения микроорганизмов, выделенных из различных почв и многолетнемерзлых осадков, нами была изолирована группа оранже-воокрашенных штаммов, фенотипически близких к B. linens. В настоящей работе представлены результаты их таксономического исследования.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили 12 оранже-вопигментированных изолятов: ВКМ Ас-2118 и ВКМ Ас-2281 (выделены из образцов многолетнемерзлых грунтов возраста 3 млн. лет, Колымская низменность, Сибирь); ВКМ Ас-2119, GK-3 и GK-4 (изолированы из почв рисовых чеков, Краснодарский край); ВКМ Ас-2280, ВКМ Ас-2279, GK-27, GK-29, GK-30, GK-32 и 49Р2 (выделены из почвенных образцов, загрязненных отходами химических и соледобывающих производств г. Березники, Пермская обл.).
Для сравнительного изучения использовались типовые штаммы B. linens ВКМ Ас-2112т, B. iodi-num В™ Ac-2106T, B. epidermidis В^ Ac-2108T, B. casei ВKM Ac-2114T, а также референтные культуры B. linens ВКМ Ас-2111 = ATCC 9175 и "B. linens" ВКМ Ас-2110 = ATCC 9174. Штаммы выращивали и поддерживали на коринебактри-альном агаре (казеин-пептон - 10 г, глюкоза - 5 г, дрожжевой экстракт - 5 г, NaCl - 5 г, 2% агара, H2O - 1 л (pH 7.0)).
Морфологические и физиологические признаки
изучали по ранее описанным методам [13, 14]. Дополнительные физиолого-биохимические свойства проверяли с использованием системы API CORYNE (bio Merieux, Франция).
Хемотаксономические признаки. Изомер диа-минопимелиновой кислоты определяли в гидро-лизатах целых клеток с помощью бумажной хроматографии. Присутствие миколовых кислот, состав менахинонов и жирных кислот определяли методами, описанными ранее [14]. Выделение тейхоевых кислот и определение их состава проводили по методу, описанному Стрешинской с соавт. [15].
Полимеразная цепная реакция повторяющихся экстрагенетических палиндромных последовательностей ДНК (Rep-ПЦР). ПЦР проводили в соответствии с методикой [16] в 25 мкл смеси, содержащей: 5 мкл 5х буфера [1 М (NH4)2SO4, 1 M mpuc-HCl, 1 M MgCl2, 0.5 M ЭДТА, pH 8.8)], 10% DMSO (об/об), 50 рМ каждого праймера, 1.25 мМ каждого из 4 дезоксирибонуклеозидтрифосфа-тов, 2 ед. акт. ДНК-полимеразы Taq ("Fermentas"), 50 нг геномной ДНК. Для амплификации использовали праймеры REP1R (5'-IIIICGICGICATCIG-GC) и REP2I (5 '-ICGICTTATCIGGCCTAC) [16]. ПЦР проводили в следующем режиме: после предварительной денатурации при 95°С в течение
6 мин следовали 30-35 циклов: денатурация -94°С, 1 мин; отжиг - 40°С, 1 мин; синтез - 65 °С, 8 мин. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1.3%-ном агарозном геле.
Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Ген 16S рРНК амплифициро-вали с универсальными эубактериальными прайме-рами (27f и 1525г). После очистки ПЦР-продукта, нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяли с использованием набора ферментов Big Dye Terminator Kit ("Perkin Elmer", США) на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer ("Perkin Elmer", США).
Филогенетический анализ. Последовательность генов 16S рРНК изучаемых штаммов выравнивали вручную с помощью программы CLUSTAL W [17]. Эволюционное расстояние, выраженное как число замен на 100 нуклеотидов, рассчитывали согласно [18]. Построение филогенетичесого древа производили с помощью пакета программ TREE-CON [19] с использованием метода neighbor-joining (NEIGHBOR). Статистическая достоверность ветвления оценивалась с помощью "bootstrap"-анализа 1000 альтернативных деревьев. Нуклео-тидные последовательности 16S рДНК штаммов ВКМ Ас-2118, ВКМ Ас-2280 и ВКМ Ас-2119 депонированы в GenBank под номерами AY243344, AY243343 и AY243345 соответственно.
Содержание Г+Ц пар в ДНК устанавливали по температуре ее тепловой денатурации [20].
ДНК-ДНК гибридизация. 3Н-меченую ДНК получали с использованием дезокси[1',2',5'-3Н]ЦТФ ник трансляционного кита N 5500 (Amersham). ДНК-ДНК-сходство определяли с помощью метода мембранных фильтров [21] (Нейлон-6, 0.2 мкм, "Hiiu Kalur", Таллин, Эстония). Гибридизацию проводили в оптимальных условиях (раствор Денхарда с 50 % формамида (об/об), 50°C, 24 ч), как описано [22].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Все изученные микроорганизмы были грампо-ложительными, неспорулирующими, неподвижными неправильными палочками, сходными по морфологии с типовым штаммом B. linens ВКМ Ac-2112T. В старой культуре (28-32 ч) преобладали укороченные палочки или кокковидные клетки. Штаммы хорошо росли на коринебактериаль-ном агаре при 24°C, формируя небольшие (2-3 мм в диаметре) округлые колонии от белого до ярко оранжевого цвета. Образование оранжевого пигмента у всех изолятов, а также типового штамма B. linens, индуцировалось светом. Исключение составили 2 референтных штамма "B. linens" ВКМ Ac-2110 и "B. linens" ВКМ Ac-2111, оранжевая окраска которых проявлялась при выращивании как на свету, так и в темноте.
220 ГАВРИШ и др.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
-Y- -Y-
Группы I II III IV V VI VII
Рис. 1. Rep-ПЦР профили ДНК оранжевоокрашенных штаммов Brevibacterium. 1 - B. linens ВКМ Ас-2112т; 2 - ВКМ Ас-2119; 3 - GK-3; 4 - GK-4; 5 - ВКМ Ас-2280; 6 - ВКМ Ас-2279; 7 - GK-27; 8 - GK-29; 9 - GK-30; 10 - GK-32; 11 - 49P2; 12 - ВКМ Ас-2118; 13 - ВКМ Ас-2281; 14 - ВКМ Ас-2111; 15 - ВКМ Ас-2110.
Выделенные организмы характеризовались типичными для бревибактерий хемотаксономически-ми признаками: мезодиаминопимелиновая кислота в клеточной стенке, менахиноны MK-8(H2), отсутствие миколовых кислот. Изучение жирных кислот у представителей изолятов из разных источников (ВКМ Ас-2119, ВКМ Ac-2280, ВКМ Ас-2118), а также типового и референтных штаммов B. linens, показало преобладание антеизо-15:0 (46-62%) и антеизо-17:0 (26-31%) кислот. Изо-16:0 и изо-17:1 кислоты составляли 1.8-8.3 и 1.1-5.7% соответственно, другие присутствовали в незначительных количествах (0.1-1.3%). У штаммов ВКМ Ac-2280 и B. linens ВКМ Ac-2112T среди липидов был обнаружен сквален в количестве 1.94 и 5.57% соответственно. Содержание Г+Ц в ДНК изолятов составило 60.1-64.3 мол. %.
Для предварительной группировки организмов по сходству ДНК и выявления близких (идентичных) штаммов использовали Rep-ПЦР (рис. 1). Анализ полученных профилей фрагментов ДНК показал, что изученные штаммы образуют 7 групп. Группы I, IV-VII представлены единичными штаммами, группа II включала шта
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.