ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 412, № 6, с. 828-831
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.218
ТРИМЕТАЗИДИН СНИЖАЕТ Са2+-ОТВЕТ НА ТАПСИГАРГИН В ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ И НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ЛИНИИ ^-60
© 2007 г. Е. И. Асташкин, М. Г. Глезер, С. В. Грачев
Представлено академиком М.А. Пальцевым 13.07.2006 г. Поступило 18.07.2006 г.
Поиск веществ, избирательно подавляющих активность Са2+-каналов плазматических мембран электроневозбудимых клеток, является актуальной медико-биологической проблемой. В нашей работе впервые показано, что антиангинальный препарат триметазидин селективно подавлял активность Са2+-каналов, активированных падением уровня Са2+ во внутриклеточных кальциевых депо в промиелоцитах человека линии HL-60, т.е. клетках-предшественниках нейтрофилов и моноцитов крови. Принципиально важно, что сам триметазидин не вызывал выхода ионов Са2+ из инози-толтрисфосфатчувствительных депо и не активировал Са2+-каналы, регулируемые такими депо. Полученные данные позволяют по-новому объяснить некоторые особенности действия триметази-дина на нейтрофилах человека, а также его эффекты при ишемии миокарда.
Изменение внутриклеточной концентрации свободных ионов Са2+ ([Са2+]г) играет важную роль в различных физиологических ответах клеток, в том числе в мышечном сокращении [1], секреции белков и биологически активных соединений [2], в запуске пролиферации и дифферен-цировке клеток [3]. Ионы Са2+ поступают в цитоплазму из двух источников - внеклеточной среды через плазматическую мембрану по Са2+-каналам и из внутриклеточных депо, морфологически связанных с сарко- или эндоплазматическим ретику-лумом ^ДО) [1].
В течение многих лет в медицинской практике используются антагонисты ионов Са2+, т.е. лекарственные препараты, селективно подавляющие активность медленного типа потенциалрегулируемых Са2+-каналов возбудимых клеток (Ъ^ОС-каналов) [2]. Следует, однако, отметить, что в электроневозбудимых клетках Са2+-каналы, активируемые депо-
Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова
ляризацией плазматических мембран, отсутствуют. В последние годы было установлено, что к одним из наиболее распространенных видов Ca2+-каналов в невозбудимых клетках относятся так называемые SOC-каналы (store operated Ca2+-channels - депорегулируемые Са2+-каналы), которые переходят в открытое состояние в результате падения содержания ионов Ca2+ во внутриклеточных ER-Ca^-депо [2]. В физиологических условиях выход ионов Ca2+ из таких депо вызывается инозитолтрисфосфатом (IP3), который действует на специфические рецепторы, экспрессиро-ванные в мембране ER-депо. Эти рецепторы образуют 1Р3-зависимые Са2+-каналы, по которым ионы Ca2+ пассивно выходят из депо в цитоплазму [4]. В настоящее время, несмотря на интенсивный поиск, специфические блокаторы SOC не обнаружены.
Триметазидин (TMZ) - активный компонент лекарственного препарата предуктал. По химической структуре TMZ является (1-[2,3,4-триметок-сифенил)метил]пиперазин гидрохлоридом. TMZ принадлежит к группе метаболических лекарственных препаратов, которые защищают клетки сердца от гибели, вызываемой ишемией [5]. Анти-ишемическое действие TMZ обусловлено его способностью частично снижать активность одного из четырех ферментов в цикле ^-окисления жирных кислот - длинноцепочечной 3-кето-ацил-КоА-тиолазы (3-КАТ) и тем самым тормозить скорость окисления жирных кислот в митохондриях (MX) кардиомиоцитов [6]. В результате в условиях ишемии происходит частичное переключение с окисления жирных кислот на окисление пирувата, который образуется в процессе гликолиза из глюкозы или лактата [7]. Усиление окисления пирувата в MX лежит в основе восстановления сопряжения между гликолизом и окислительным фосфорилированием, увеличения образования АТФ, компенсации метаболического ацидоза, снижения содержания в цитоплазме H+,
[Са2+];, нМ 600
350
100
10
20
Время, мин
Рис. 1. Влияние формилпептида (FMLP), тапсигаргина (TG), триметазидина (TMZ) и иономицина (IM) на внутриклеточную концентрацию ионов Са ([Са ],-) в дифференцированных HL-60 клетках. FMLP - 1 мкМ; FMLP - 4 мкМ; TG - 1 мкМ; TMZ - 50 мкМ; IM - 0.1 мкМ; IM - 0.5 мкМ.
Са2+, улучшения сократительной активности миокарда [8]. Следует подчеркнуть, что при окислении глюкозы (пирувата) в МХ на синтез эквивалентного количества АТФ расходуется примерно на 10-12% меньше кислорода по сравнению с окислением жирных кислот [9], что имеет важное значение при ишемии.
Однако торможение окисления длинноцепо-чечных жирных кислот в МХ на любом этапе их метаболизма неизбежно сопровождается накоплением этих высоко биологически активных соединений в цитоплазме клеток сердца, что чревато опасными последствиями, в том числе синтезом и накоплением липидов (жировая дистрофия), разобщением окислительного фосфорилирования (падение уровня образования АТФ) и нарушением барьерных свойств сарколеммы (изменение ионного гомеостаза, гибель клетки по механизму коллоидно-осмотического лизиса - некроза). В многочисленных исследованиях на лабораторных моделях, в клинических испытаниях, а также при длительном применении предуктала перечисленных выше изменений обнаружено не было. Изучение этого вопроса показало, что TMZ не только тормозил окисление жирных кислот в МХ, но также индуцировал их включение в фосфолипиды мембран, в том числе фосфатидилинозитольные фосфолипиды сарколеммы [10]. Было обнаружено, что TMZ резко увеличивал активность фофатидил-синтазы - ключевого фермента, играющего важную роль в регуляции цикла обмена - мембранные фосфатидилинозитолы (Р1) и цитозольные инозитолфосфаты (1Р). В результате такого действия TMZ в цитоплазме изменяются уровни ино-зитолфосфатов, в том числе инозитолтрисфосфа-та (1Р3), а также снижается накопление жирных кислот, возрастает стабильность наружной мембраны,
восстанавливаются ее барьерные свойства [11]. Включение жирных кислот в компоненты мембраны способно изменять ее физико-химические свойства, микровязкость, а также активность различных мембранных белков, в том числе входящих в состав ионных каналов.
В связи с этим целью нашей работы было изучить влияние TMZ на активность SOC-каналов в клетках-предшественниках нейтрофилов и моноцитов человека линии HL-60.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Использовались тапсигаргин (TG), формил-пептид (FMLP), иономицин (IM), дигитонин, EGTA, Фура-2/АМ, форбол-12-миристат-13-аце-тат (РМА), дибутирил-сАМР и DMSO фирмы "Sigma".
Культуры клеток. Клетки линии HL-60 росли при 37°С в С02-инкубаторе в пластиковых культуральных флаконах (75 см2) в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка, 5 мкг гентамицина/мл, 100 единиц пенициллина/мл, 100 мкг стрептомицина/мл и 2 ммоль глютамина. Клетки пересевали в пропорции 1 : 5 каждые 2-3 дня. Дифференцировку HL-60-кле-ток индуцировали с помощью воздействия стандартных агентов - РМА или дибутирил-сАМР, с которыми клетки инкубировали 72 ч [13, 14]. Измерение [Са2+],- проводили, как описано в работе [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены результаты, полученные на дифференцированных HL-60-клетках.
830
АСТАШКИН и др.
TMZ
Рис. 2. Влияние формилпептида (FMLP), тапсигарги-на (TG) и триметазидина (TMZ) на внутриклеточную концентрацию ионов Ca2+ ([Ca2+],) в недифференцированных HL-60-клетках. FMLP - 4 мкМ; TG - 1 мкМ; TMZ - 20 мкМ.
Бактериальный трипептид - FMLP вызывал увеличение [Ca2+]. Эти данные свидетельствуют о том, что в плазматической мембране дифференцированных HL-60-клеток экспрессированы рецепторы для FMLP. Как известно, в результате взаимодействия FMLP с рецепторами происходит G-белокопосредуемая активация фосфолипазы С (PLC), что приводит к гидролизу мембранных фосфатидилинозитолов, из которых образуются два вторичных мессенджера: стимулятор проте-инкиназы С - диацилглицерин (DAG) и инозитол-трисфосфат (IP3). Последний вторичный мессен-джер выделяется из мембраны в цитоплазму и в результате взаимодействия со специфическими рецепторами внутриклеточных кальциевых депо вызывает выход ионов Ca2+ из депо в цитоплазму. Снижение содержания ионов Ca2+ в просвете депо активирует кальциевые каналы, регулируемые депо (SOC-каналы), которые переходят в открытое состояние [2, 4]. Поскольку время жизни IP3 ограничено, а его взаимодействие с рецепторами депо происходит дискретно, Са2+-эффект FMLP обратим и длится недолго.
Если дифференцированные HL-60-клетки после FMLP обрабатывали селективным ингибитором Са2+-АТФазы кальциевого депо - тапсигар-гином (TG, 1 мкМ), наблюдалось увеличение значений [Ca2+], которые возрастали до максимума, а затем снижались до стационарного уровня. Ca2+-ответ HL-60-клеток на TG состоит из двух взаимосвязанных процессов: быстрого пассивного выхода Ca2+ по "leak''-каналам по градиенту концентрации из депо в цитоплазму и более медлен-
Рис. 3. Влияние триметазидина (TMZ), тапсигаргина (ТО) и иономицина (1М) на внутриклеточную концентрацию ионов Са2+ ([Са2+]г) в дифференцированных ^-60-клетках. TMZ - 10 мкМ; TMZ - 10 мкМ; TMZ -10 мкМ; TG - 1 мкМ; 1М - 0.3 мкМ.
ного транспорта Са2+ по SOC-каналам, активированным падением концентрации Са2+ в депо. Ин-гибиторное действие TG на Са2+-насос депо было необратимо. Это иллюстрируется результатами опытов, в которых НЬ-60-клетки первоначально обрабатывались TG, а затем FMLP. В этом случае TG полностью подавлял кальциевый ответ клеток на бактериальный формилпептид. Следует отметить, что действие TG на клетки происходит в "обход" рецепторов плазматических мембран и образования вторичных мессенджеров.
Триметазидин (ХМ^, добавленный к ^-60-клеткам после TG, вызывал снижение [Са2+] (рис. 1). Этот ингибиторный эффект TMZ зависел от концентрации и наблюдался в области 5-100 мкМ. Несмотря на снижение [Са2+], вызываемое TG, триметазидин не влиял на кальциевый ответ, индуцированный в этих же клетках подвижным переносчиком ионов Са2+-ионофорным антибиотиком иономицином. Дифференцированные HL-60-клетки обладали высокой чувствительностью к действию иономицина, который срабатывал уже в концентрации 0.1 мкМ.
Таким образом, TMZ снижал содержание ионов Са2+ в цитоплазме дифференцированных HL-60-к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.