МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 466-475
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.674;663.15
ТРОФИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ И МИКРОБНЫЙ ПРОФИЛЬ ЭВОЛЮЦИОННО СЛОЖИВШЕЙСЯ АССОЦИАТИВНОЙ КУЛЬТУРЫ КЕФИРНЫХ ЗЕРЕН © 2015 г. А. А. Хохлачева*, 1, М. А. Егорова**, А. Н. Калинина***, Н. Б. Градова*
*Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова ***Государственный НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
Поступила в редакцию 25.12.2014 г.
Для анализа ассоциативной культуры кефирных грибков применено сочетание микробиологических методов определения функциональной активности выделенных микробных изолятов и моле-кулярно-биологических методов их идентификации. Совокупность 168 рРНК анализа и денатурирующего градиентного гель-электрофореза позволила определить микробный профиль кефирных грибков и выявить среди компонентов ассоциации молочнокислые бактерии двух физиологических групп, отличающихся способностью использования лактозы для молочнокислого брожения. На основании исследования функциональной активности и микробного профиля кефирных грибков, длительное время (более 4-х лет) культивируемых на молоке, не содержащем лактозу, показана роль индуцибельного фермента Р-галактозидазы молочнокислых бактерий в функциональной устойчивости микробного сообщества кефирных грибков. Полученные данные расширяют общее представление о возможных трофических закономерностях рассматриваемых микробных сообществ и могут быть использованы для разработки алгоритма экспериментального создания функционально устойчивой ассоциативной культуры кефирных грибков.
Ключевые слова: кефирные грибки, эволюционно сложившееся микробное сообщество, трофические закономерности функционирования, микробный профиль.
DOI: 10.7868/S0026365615040102
Формирование и функционирование морфологически оформленных эволюционно сложившихся микробных сообществ, которые являются доминирующей, наиболее устойчивой и метаболически активной формой существования микроорганизмов в природных и ряде техногенных экосистем, в которых они занимают определенные экологические ниши, привлекает внимание исследователей не только как объект для познания механизмов организации природных экосистем, но и как основа для разработки способов создания новых функционально направленных, практически ценных микробных сообществ.
В последние годы показано участие тонких механизмов, основанных на химической коммуникации микроорганизмов, в объединении их в сообщества [1, 2]. Однако важнейшую роль в превращении сообщества микроорганизмов в систему, действующую как определенное единое целое, являются трофические взаимоотношения [3—5].
1 Автор для корреспонденции (e-mail: sasha-88888@yandex.ru).
Одним из стабильно функционирующих микробных сообществ, длительное время используемых в промышленных условиях для получения кисломолочного продукта кефира, являются кефирные грибки. Их микробный состав и функциональные свойства были предметом изучения на протяжении многих лет, в результате чего выявлены основные трофические потоки и их участники: использующие лактозу гомо- и гетероферментатив-ные молочнокислые бактерии, образующие молочную кислоту; дрожжи, использующие молочную кислоту в спиртовом брожении; уксуснокислые бактерии, использующие этанол [6, 7]. При исследовании видового состава микроорганизмов авторами был выявлен разный микробный состав исследованных кефирных грибков из разных техногенных систем. По литературным данным в кефирных грибках определены более 20 разных видов молочнокислых бактерий, около 20 видов дрожжей, как использующих для брожения лактозу, так и не использующих ее [8].
На основании этих данных можно было бы предположить, что кефирные грибки представля-
ют систему, характеризующуюся различным микробным составом, но выполняющую одинаковые функции, сохраняющую неизменными пути превращений исходного субстрата. Однако имеющиеся литературные данные не дают основания для подтверждения этого положения. Остается много нерешенных вопросов, касающихся трофических связей микроорганизмов в кефирных грибках, в частности, не определены микроорганизмы-продуценты данной системы, не выяснены взаимоотношения между молочнокислыми бактериями разной видовой и родовой принадлежности и др. Отсутствуют данные, позволяющие разработать функциональную модель сложившегося консорциума кефирных грибков, которая необходима для разработки способов управления этой системой и создания экспериментально полученного стабильного консорциума.
Целью настоящей работы явилось изучение микробного профиля кефирных грибков, используемых на различных молочных производствах, а также трофических взаимоотношений между микробными компонентами этих консорциумов, как основы для построения функциональной модели данной системы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования были кефирные грибки, применяемые в производстве кефира на молочных предприятиях г. Ставрополя (КГС), г. Гагарина (КГГ) и лиофилизированные кефирные грибки, используемые на предприятиях г. Москвы (КГМ). Основные исследования проводили с кефирным грибком, используемым для получения кефира на молочном предприятии г. Ставрополя.
Кефирные грибки культивировали в микро-аэрофильных условиях на нативном молоке Par-malat 0.5% жир. (lac+) и на молоке, не содержащем лактозы, Valio Zero Lactose, 1.5% жир. (lac—). Используемые образцы молока содержали практически одинаковое суммарное количество углеводов.
Функциональные свойства кефирных грибков
определяли по активности воздействия их культур, полученных после культивирования кефирных грибков на молоке и последующего их отделения (в производстве называемых заквасками), на молоко. Культуры использовали в качестве посевного материала из расчета 1 мл на 10 мл молока. В качестве критериев оценки функциональной активности культур кефирных грибков и микроорганизмов, выделенных из них, использовали стандартные показатели: образование сгустка и его характер, изменение рН среды, показатели титруемой кислотности молока (°Т), на основании которой рассчитывали количество образуе-
мой молочной кислоты и количество сброженной лактозы [9].
Активность спиртового брожения определяли классическим методом в сосудах Эйнгорна-Смита по доле пространства, занимаемого пузырьком газа в закрытом колене, и выражали в относительных единицах 1, 0.5, 0.3, 0.15 (по объему вытесняемой жидкости). Инкубирование проводили в течение трех суток на питательной среде следующего состава: дрожжевая вода (7—10 г/л сухих дрожжей), 2% лактозы (глюкозы, галактозы), 0.1% K2HPO4 и 0.5% NaCl [10, 11].
ß-Галактозидазную активность микроорганизмов определяли по их кислотообразующей способности [9], а также при использовании хромогенного субстрата X-Gal [12].
Концентрацию сахаров (глюкозы и галактозы) в культуральной жидкости определяли в динамике при периодическом культивировании Leuconostoc gelidum методом тонкослойной хроматографии. L. gelidum культивировали в микроаэрофиль-ных условиях в жидкой среде следующего состава, г/л: глюкоза — 30, дрожжевой экстракт — 15, MnSO4 ■ 5H2O - 0.05, MgSO4 • 7H2O - 1, К2НРО4 - 2. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах силикагеля 60 F254 ("Merck", Германия), в качестве растворителя использовали смесь изопропиловый спирт : этилацетат : вода в соотношении 7 : 1 : 2, в качестве проявителя — 2% щелочной раствор хлористого 2,3,5-трифенил-тетразолия в спирте [13].
Способность использовать разные источники углерода для молочнокислого брожения определяли по изменению показателей рН и титруемой кислотности (°Т) при культивировании выделенных изолятов в жидкой среде, г/л: (NH4)2SO4 — 5, KH2PO4 - 1, KCl - 0.15, MgSO4 • 7H2O - 0.2, CaCl2 -0.05, дрожжевой экстракт - 5, с глюкозой, лактозой или галактозой - 20 г/л [9].
Для сравнительной оценки состава экзополиса-харидов, продуцируемых кефирными грибками, последние термически обрабатывали в кипящей воде, полисахариды выделяли многократным переосаждением спиртом [14]. ИК-спектры полученных лабораторных образцов экзополисахаридов записывали с помощью Фурье-ИК-спектрометра Tensor-27 ("Bruker"), оснащенного приставкой НПВО Miracle ("Pike Technologies"). В работе использовали НПВО-кристалл из Ge на 1 отражение. Дополнительно записывали спектры ИК в режиме "на пропускание", используя приставку Microfo-cus ("Perkin-Elmer"), а также тонкие пластины кристаллического кремния. В последнем случае образцы наносили на поверхность кремния из водного раствора, а спектры записывали после испарения воды. Обработку ИК- и КР-спектров осуществляли с помощью ПО OPUS v/6.5 ("Bruker").
Таблица 1. Бактериальный профиль кефирных грибков из разных техногенных ниш
Кефирные грибки
КГС
КГГ
Lactococcus lactis
Leuconostoc mesenteroides
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus sakei
Lactobacillus sp.
КГМ
Lactobacillus delbrueckii
Leuconostoc gelidum
Lactobacillus kefiri
Для сравнения микробного профиля кефирных грибков использовали метод денатурирующего градиентного гель электрофореза (DGGЕ) [17].
Электронно-микроскопические исследования
проводили на базе ИФБМ им. Г.К. Скрябина. Для исследований кефирные зерна фиксировали в 1.5%-ом растворе глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч; отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1%-ом растворе 0804 в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2). После обезвоживания в серии спиртов образцы напыляли платино-углеродной смесью в вакуумной установке JEE-4X ('^ЕОЕ', Япония). Образцы просматривали в сканирующем электронном микроскопе JSM 65101У ('^ЕОЕ', Япония) [18].
Для определения микробного состава кефирных зерен их измельчали стерильным лезвием, растирали в ступке до однородной массы, суспендировали в 1% растворе триптона ("Serva", Германия). Высев проводили на традиционно используемые твердые среды: (а) дрожжевая среда, г/л: глюкоза (лактоза) — 30, дрожжевой экстракт — 10, СаСО3 — 20, агар — 15; (б) среда Сабуро (глюкозо-пептонная), г/л: глюкоза — 40, пептон — 10, дрожже
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.