СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 200S, том 22, № 2, с. 139-142
ЗРИТЕЛЬНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СИСТЕМА
УДК 612.86
цГМФ-РЕГУЛИРУЕМАЯ ПРОВОДИМОСТЬ on-БИПОЛЯРНЫХ КЛЕТОК
НЕ АКТИВИРУЕТСЯ РЕАГЕНТАМИ, МОДИФИЦИРУЮЩИМИ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫЕ ГРУППЫ
© 2008 г. Г. Р. Каламкаров, О. Г. Лунгина
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4 E-mail: kalam2@rambler.ru Поступила в редакцию 06.08.2007 г.
Известно, что регулируемые циклическими нуклеотидами каналы (ЦН-каналы) фоторецепторной клетки могут активироваться путем модификации сульфгидрильных групп, находящихся в активном центре этих ионных каналов, но не могут активироваться оксидом азота. ЦН-каналы обонятельной клетки могут быть прямо активированы как оксидом азота, так и вследствие модификации сульфгидрильных групп белка канала. Тем не менее in vivo в рецепторных клетках оксид азота не участвует ни в модуляции, ни в активации механизма усиления. Мы показали, что цГМФ-чувстви-тельные каналы оп-биполярных клеток, в которых NO является модулятором работы гуанилатцик-лазы, не могут быть прямо активированы путем модификации сульфгидрильных групп, а, следовательно, и оксидом азота.
Ключевые слова: ЦН-каналы, оп-биполярные клетки, SH-реагенты, оксид азота.
В сетчатке позвоночных реализуются два способа передачи и обработки фотосигнала, опосредованные on- и off-биполярными клетками. Оба типа клеток образуют синапсы с фоторецепторами, но в ответ на свет генерируют электрические импульсы противоположных полярностей. Ответы оп-биполярных клеток вызваны активацией метаботропных рецепторов в пресинаптическом окончании клетки. Вследствие уменьшения концентрации глутамата в синаптической щели между фоторецепторной и биполярной клетками происходит активация каскада, связанного с G-бел-ком, в результате чего изменяется концентрация внутриклеточного цГМФ, уменьшается катион-ная цГМФ-регулируемая проводимость, и клетка деполяризуется в ответ на свет (Shiells, Falk, 1992a; Nawy, Jahr, 1990). Установлено, что эта проводимость модулируется оксидом азота (Savchenko et al., 1997). В off-биполярах уменьшение концентрации глутамата в синаптической щели вызывает активацию ионотропных рецепторов, и клетка, напротив, гиперполяризуется (Attwell et al., 1987). Вследствие различий этих двух механизмов коэффициент усиления сенсорного сигнала в on-биполярах существенно выше, чем в off-бипо-лярах (Falk, 1989).
Для реализации такого усилительного механизма в on-биполярах содержатся все элементы, присущие рецепторной системе, активируемой G-белками: G-белок, фосфодиэстераза, цГМФ-ак-
тивируемые ионные каналы. Кроме того, система усиления модулируется оксидом азота, который может активировать гуанилатциклазу и таким образом изменять концентрацию цГМФ в клетке. Показано, что концентрация оксида азота (NO) в наружном синаптическом слое достаточно высока (Каламкаров и др., 2002).
Регулируемые циклическими нуклеотидами каналы (ЦН-каналы) обонятельной клетки могут быть активированы как оксидом азота, так и вследствие модификации сульфгидрильных групп белка канала (Broillet, Firestein,1996). Ранее нами было показано, что цГМФ-активируемые ионные каналы фоторецепторной клетки могут активироваться прямо - путем модификации сульфгидрильных групп, находящихся в активном центре этих ионных каналов (Donner et al., 1990), но не могут активироваться оксидом азота. Тем не менее in vivo в рецепторных клетках оксид азота не участвует ни в модуляции, ни в активации механизма усиления. В этой связи интересно выяснить, могут ли цГМФ-чувствительные каналы оп-биполярных клеток, в которых NO является модулятором, прямо активироваться оксидом азота путем модификации сульфгидрильных групп.
МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на сетчатках Caras-sius auratus. Предварительно животных адаптиро-
Мембранный потенциал, mV -40 -30 -20 -10
-10
-20 1 м
о т о
-30 J О
-40
Рис. 1. Влияние Ь-^-ёПйагеш на амплитуду фотоответа оп-биполярных клеток. Темный квадрат - фотоответ оп-биполярной клетки в стандартных условиях (раствор Рингера); темный кружок - фотоответ оп-биполярной клетки при добавлении Ь-^-ёПйагеш в микроэлектрод в концентрации 1 мМ.
вали в темноте, выделение сетчатки проводили при слабом красном свете. Для получения тонких поперечных срезов сетчатку помещали на милли-поровый фильтр и разрезали на полоски толщиной 100-200 мкм. Срезы сетчатки инкубировали в охлажденном растворе Рингера, содержащем 260 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 4 мМ СаС12, 20 мМ NaHCO3, 10 мМ глюкозы, 350 мМ мочевины, 5 мМ HEPES рН 7.5. Фотоответы биполярных клеток регистрировали методом "пэтч-кламп" в конфигурации "whole-cell". Все эксперименты проводили при комнатной температуре (20-25°C). Микроэлектроды изготавливали из боросиликатного стекла (World Precision Instruments, TW150F-4), стеклянный электрод заполняли бескальциевым раствором, содержащим 280 мМ CsCL, 5 мМ EGTA, 5 мМ MgSO4, 10 mM HEPES рН 7.3, 1 мМ АТФ, 0.5 мМ ГТФ. Фототок регистрировался при помощи усилителя Axopatch 200B и через аналого-цифровой преобразователь DigiData 1200 записывался в компьютер. Сигнал анализировали при помощи программного обеспечения pClamp6 (Axon Instruments, Foster City, CA). On-биполярные клетки определяли по их характерной форме и полярности ответа на свет. В качестве реагентов, модифицирующих SH-группы, использовали io-doacetamide (IAA), p-chlormercuriphenylsulfonic acid (PCMP) и N-ethylmaleimide (NEM), все реактивы "Sigma".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследовать модификацию цГМФ-регулируе-мых каналов SH-реагентами или оксидом азота методом регистрации тока одиночного канала не представляется возможным, так как их плотность в мембране клетки слишком мала для того, чтобы успешно получить необходимый мембранный фрагмент. Тот факт, что биполяры содержат цГМФ-регулируемые каналы, может быть доказан на основании того, что их проводимость блокируется дилтиаземом (L-cis-diltiazem), причем это воздействие потенциал-зависимо (так же, как и в аналогичных каналах из других клеток). Поскольку мы предполагаем, что модификация сульфгидрильных групп цГМФ-зависимых каналов может приводить к такому же действию, что и цГМФ, то эффект введения в клетку SH-реаген-тов должен быть аналогичен эффекту ингибиро-вания фосфодиэстеразы, т.е. должно наблюдаться увеличение мембранной проводимости в ответ на деполяризацию клетки и увеличение амплитуды фотоответов. Добавление блокаторов SH-групп прямо в инкубационную среду нецелесообразно, так как взаимодействие SH-реагентов с цГМФ-ка-налами фоторецепторов приведет к увеличению амплитуды их фотоответа. Кроме того, будет невозможно дифференцировать эффект влияния SH-реагентов непосредственно на ток цГМФ-ка-налов биполярной клетки от действия, опосредованного фоторецепторами. Поэтому эксперименты проводились в конфигурации "whole-cell", а действующее вещество добавляли непосредственно в микроэлектрод, откуда оно проникало в клетку.
В качестве контроля, для подтверждения корректности регистрации тока цГМФ-зависимых каналов, мы вводили в измерительный электрод дилтиазем (1 мМ) - классический блокатор цГМФ-регулируемых каналов. После того, как концентрации дилтиазема внутри микроэлектрода и внутри клетки выравнивались, наблюдалось уменьшение суммарной проводимости мембраны и уменьшение величины фотоответов (рис. 1).
Эксперименты с реагентами, модифицирующими SH-группы, проводились сходным образом. В пипетку добавляли 2 мМ IAA, 0.5 мМ NEM или 1 мМ РСМР. Добавление оксида азота нецелесообразно, так как невозможно будет отличить действие NO непосредственно на каналы от влияния на концентрацию цГМФ в клетке.
На рис. 2 приведены типичные результаты одного из экспериментов, в которых IAA добавлялся непосредственно в микроэлектрод и поэтому проникал только в исследуемую биполярную клетку. На графике указаны величины фотоответов оп-биполярных клеток на одинаковые вспышки света, зарегистрированные при разных значениях фиксации потенциала. В эксперимен-
0
цГМФ-РЕГУЛИРУЕМАЯ ПРОВОДИМОСТЬ
141
тах с РСМР и NEM получены аналогичные результаты (на рисунке не представлены).
Ранее нами было показано, что эти реагенты не проникают через мембрану (Donner et al., 1990), т.е. их косвенное действие незначительно. Добавление в пипетку IAA не меняло потенциал покоя клетки, что можно было предполагать, если бы проницаемость каналов изменялась под влиянием SH-реагентов. Практически не изменялась и величина фотоответов (рис. 2).
Показано, что введение реагентов, модифицирующих сульфгидрильные группы, не изменяло проводимость оп-биполярных клеток. Таким образом, модификация SH-групп не приводит к изменению проводимости цГМФ-регулируемых ионных каналов.
Ионные каналы, регулируемые цГМФ, являются одним из ключевых элементов механизма генерации ответов биполяров на падение концентрации глутамата в синаптической щели. Этот процесс модулируется оксидом азота, причем основным путем такой модуляции является изменение концентрации цГМФ в результате активации растворимой гуанилатциклазы (Shiels, Falk, 1992b), а не прямое изменение проводимости ионных каналов. Вероятность прямой активации данных каналов оксидом азота можно лишь предполагать, основываясь на том, что такая модуляция показана, по крайне мере, на двух типах ЦН-регулируе-мых каналов: из обонятельных клеток (Broillet, Firestein,1996) и из слуховых волосковых клеток органа Корти (Каламкаров и др., 1999).
То, что мы не обнаружили никакого влияния SH-реагентов на мембранную проводимость и фотоответы оп-биполярных клеток, на первый взгляд, удивительно. Как отмечалось выше, биполярные клетки содержат усилительный каскад, включающий G-белок, фосфодиэстеразу и гуани-латциклазу, и логично было предположить, что модификация сульфгидрильных групп будет изменять активность, по крайне мере, двух ферментов - фосфодиэстеразы и гуанилатциклазы. Однако подобный эффект не был обнаружен ни в этой работе, ни в аналогичной работе, выполненной на фоторецепторных клетках: йодацетамид не влиял на активность ферментов, регулирующих уровень цГМФ. При этом во втором случае йодацетамид влиял на проводимость ионных каналов, а именно, активировал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.