ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 417, № 2, с. 283-285
ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 581.1:577.23
ЦИКЛОСПОРИН А-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ПОРА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОМ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССАХ
© 2007 г. Н. С. Павловская, О. В. Савинова, О. И. Грабельных, Т. П. Побежимова, Н. А. Королева, В. К. Войников
Представлено академиком И.Ф. Жимулевым 15.05.2007 г. Поступило 15.05.2007 г.
В последнее время изменение проницаемости митохондриальных мембран привлекает большое внимание в связи с тем, что разобщение окислительного фосфорилирования и набухание матрик-са митохондрий являются событиями, предшествующими открытию в митохондриях высокопроницаемой поры ("Permeability transition pore", РТР), высвобождению цитохрома с и инициации программируемой клеточной смерти [1-6]. Механизм индукции митохондриальной поры у растений мало изучен. Существование классической циклоспорин А-чувствительной поры [1] в растительных митохондриях до сих пор обсуждается, а данные о влиянии стрессовых факторов на процессы, происходящие при открытии РТР у растений и приводящие к клеточной гибели, фрагментарны [5, 7-12].
В связи с этим целью работы было определение возможности существования циклоспорин А-чув-ствительной поры в митохондриях проростков озимой пшеницы и изучение изменения ее свойств при низкотемпературном и окислительном стрессах.
В работе использовали побеги 3-дневных этиолированных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорта Иркутская озимая), выращенных на влажной фильтровальной бумаге при 26°С. Проростки подвергали как кратковременной холодовой обработке - холодовой шок (ХШ) (-4°С, 1 ч), так и длительной - холодовое закаливание (ХЗ) (4°С, 7 сут). Также использовали проростки озимой пшеницы, которые после холо-дового воздействия были сразу подвергнуты действию окислительного стресса, вызываемого обработкой проростков 0.5 мМ Н202 в течение 4 ч.
Митохондрии выделяли из побегов проростков с помощью дифференциального центрифугирования по ранее описанному методу [13]. Энергетическую активность митохондрий определяли полярографически при 27°С, используя платиновый электрод закрытого типа в ячейке объемом 1.4 мл [14]. Реакционная среда содержала 18 мМ КН2Р04, 125 мМ KCl, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ MgCl2, рН 7.4. В качестве субстратов окисления использовали 10 мМ малат в присутствии 10 мМ глута-мата, 8 мМ сукцинат в присутствии 5 мМ глутама-та и 1 мМ НАДН. При окислении сукцината и НАДН в среду инкубации добавляли 3 мкМ роте-нон. В качестве ингибитора митохондриальной поры был использован 1 мкМ циклоспорин А, эффект которого выступает диагностическим признаком классической РТР, а индукторами служили 1.75 мМ Ca2+ и 50 мкМ пальмитиновая кислота (С16:0).
Набухание митохондрий измеряли спектрофо-тометрически по снижению оптической плотности (ОП) митохондриальной суспензии (0.25 мг/мл) в течение 10 мин при 26°С и 540 нм в среде, содержащей 200 мМ KCl и 20 мМ MOPS, рН 7.4 [15]. Время преинкубации митохондрий с циклоспорином А и Ca2+ составляло 5 мин при 0°С.
Показано, что скорость дыхания и набухание митохондрий озимой пшеницы из не подвергнутых стрессовым воздействиям проростков являются чувствительными к действию циклоспорина А. Наиболее ярко это проявлялось при использовании малата в качестве субстрата окисления (рис. 1а, рис. 2). Действие ионов Ca2+ и пальмитиновой кислоты, как индукторов митохондриальной поры, также было наиболее выражено при окислении малата - субстрата комплекса I дыхательной цепи (рис. 1а, рис. 2). Как ХШ, так и ХЗ приводили к снижению чувствительности процессов дыхания и набухания изолированных митохондрий к циклоспорину А (рис. 1, рис. 2). Ионы Ca2+ увеличивали циклоспорин А-нечув-ствительную скорость нефосфорилирующего
Сибирский институт физиологии и биохимии растений
Сибирского отделения Российской Академии наук, Иркутск
284
ПАВЛОВСКАЯ и др.
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
(а) □ ЦА
Са2+ + ЦА ПК + ЦА
ПП Са2+ Э ПК
а и
о &
о
§ 200
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
о о 200 -
к н 180 _
О
160 -
140 -
120 -
100 -
80 -
60 -
40 -
20 -
0
(в)
К
хш
хз хш + ОС хз + ОС
Рис. 1. Чувствительность скорости нефосфорилирующего дыхания ^4) митохондрий озимой пшеницы из контрольных (К), подвергнутых холодовому шоку (-4°С, 1 ч) (ХШ), холодовому закаливанию (4°С, 7 сут) (ХЗ), ХШ с последующим окислительным стрессом (0.5 мМ Н2О2, 4 ч) (ХШ + ОС) и ХЗ с последующим окислительным стрессом (ХЗ + ОС) проростков к циклоспорину А (1 мкМ) (ЦА) в присутствии Са2+ (1.75 мМ) и пальмитиновой кислоты (50 мкМ) (ПК). За 100% принята V4 в отсутствие агентов. п = 3-8. а - субстрат окисления 10 мМ малат +10 мМ глута-мат; б - субстрат окисления 8 мМ сукцинат +5 мМ глутамат; в - субстрат окисления 1 мМ НАДН.
дыхания и степень набухания митохондрий (рис. 1, рис. 2), эффект действия ионов кальция становился более выраженным при окислении сукци-ната после ХШ (рис. 16) и при окислении НАДН после ХЗ (рис. 1в), тогда как пальмитиновая кислота вызывала циклоспорин А-чувствительную стимуляцию скорости дыхания и набухания митохондрий (рис. 1, рис. 2). Следует отметить, что эффект индукторов митохондриальной поры был
значительно выражен в митохондриях из проростков, подвергнутых ХШ (рис. 1, рис. 2). Последующий за ХШ и ХЗ окислительный стресс приводил к появлению чувствительности митохондрий озимой пшеницы к циклоспорину А, однако процессы дыхания и набухания митохондрий не индуцировались инкубацией с ионами Са2+ и пальмитиновой кислотой (рис. 1, рис. 2).
ЦИКЛОСПОРИН А-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ПОРА
285
Разница ОП540 за 5 мин 70
60 50 40 30 20 10 0
□ Без агентов Ш ЦА Са2+
ЦА + Са2+ ПК
ЦА + ПК
ш
К
хш
хз хш + ОС хз + ОС
Рис. 2. Чувствительность набухания митохондрий озимой пшеницы из контрольных, подвергнутых хо-лодовому шоку (-4°С, 1 ч), холодовому закаливанию (4°С, 7 сут), ХШ с последующим окислительным стрессом (0.5 мМ Н2О2, 4 ч) и ХЗ с последующим окислительным стрессом проростков через 5 мин инкубации к циклоспорину А (1 мкМ) (ЦА) в присутствии Са2+ (1.75 мМ) и пальмитиновой кислоты (50 мкМ). Обозначения те же, что на рис. 1. Разницу оптической плотности (ОП) рассчитывали по формуле: (ОЩ -ОЩ) х 100, где ОШ0 - начальная ОП, ОГО1 - ОП через определенное время. М ± т, п = 3-4.
Показанное нами циклоспорин А-чувстви-тельное, Са2+/пальмитатзависимое разобщение окислительного фосфорилирования и набухание митохондрий побегов проростков озимой пшеницы указывают на открытие высокопроницаемой митохондриальной поры. Способность циклоспорина А ингибировать процессы дыхания и набухания митохондрий исчезает после низкотемпературного воздействия на проростки и появляется после следующего за низкотемпературным окислительного стресса, что позволяет предположить изменение свойств митохондриальной поры в условиях стресса. Следует заметить, что, в отличие от обнаруженной нами чувствительности набухания митохондрий из побегов проростков озимой пшеницы к циклоспорину А, Virolamen с соавторами [10] на митохондриях из корней проростков озимой пшеницы обнаружили нечувствительность набухания к данному ингибитору. Можно предположить, что механизмы индукции и регуляции открытия РТР в митохондриях зависят даже от функциональной роли того или иного
органа растения. Полученные нами данные согласуются с предположением других авторов о нескольких функциональных состояниях высокопроницаемой поры как в митохондриях животных, так и растений [10, 11] и указывают на то, что индукция и регуляция PTP может происходить посредством нескольких механизмов и требует специфических условий.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы Президиума РАН "Био-оразнообразие и динамика генофондов" (проект 11.16), грантов Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ РФ (НШ-4812.2006.4) и поддержки молодых российских ученых (МК-1876.2007.4), междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН № 47, молодежного проекта СО РАН № 115, грантов РФФИ № 07-04-01055 и 05-04-97231 и Фонда содействия отечественной науке.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bernardi P. // Biochim. et biophys. acta. 1996. V. 1275. P. 5-9.
2. Hirsch T, Susin S.A., Marzo I. et al. // Cell. Biol. Toxicol. 1998. V. 14. P. 141-145.
3. Crompton M. // Biochem. J. 1999. V. 341. P. 233-249.
4. Huang X, Zhai D, Huang Y. // Mol. and Cell. Biochem. 2001. V. 224. P. 1-7.
5
8
9
Curtis M.J., Wolpert TJ. // Plant J. 2002. V. 29. P. 295312.
Zoratti M, Szabo I. // Biochim. et biophys. acta. 1995. V. 1241. P. 139-176.
Arpagaus S., Rawyler A., Braendle R. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 1780-1787.
Tiwari B.S., Belenghi B, Levine A. // Plant Physiol. 2002. V. 128. P. 1271-1281.
Fortes F, Castilho R.F., Catisti R. et al. // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. V. 33. P. 43-51.
10. Virolainen E, Blokhina O., Fagerstedt K. // Ann. Bot. 2002. V. 90. P. 509-616.
11. He L, Lemasters J.J. // FEBS Lett. 2002. V. 512. P. 1-7.
12. Yu X.-H, Perdue TD, Heimer Y.M., Jones A.M. // Cell Death and Differentiation. 2002. V. 9. P. 189-198.
13. Побежимова Т.П., Грабельных О.И., Колесничен-ко А.В. и др. // Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 238-244.
14. EstabrookR.W.// Meth. Enzimol. 1967. V. 10. P. 41-47.
15. Pavlovskaya N.S., Grabelnych O.I, Pobezhimova TP. et al. // Annu. Wheat Newslett. 2006. V. 52. P. 114-116.
6
7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.