БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 3, с. 191-195
УДК 577.23
ЦИКЛОСПОРИН А ИНГИБИРУЕТ ПРОТОНОФОРНУЮ РАЗОБЩАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ЛАУРАТА
В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ
© 2008 г. В. Н. Самарцев, О. В. Кожина, С. Р. Рыбакова
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (836-2)56-57-81; электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 05.12.2007 г.
Исследовано влияние циклоспорина А, карбоксиатрактилата и глутамата на протонофорное разобщающее действие лаурата в митохондриях печени. Установлено, что в концентрации 5 мкМ циклоспорин А частично ингибирует стимулированное лауратом дыхание митохондрий. Это свидетельствует о его способности снижать протонофорную активность этой жирной кислоты, т.е. о ресопря-гающем действии. При этих условиях циклоспорин А не влияет на способность карбокситрактилата и глутамата ингибировать разобщающее действие лаурата. В свою очередь эти соединения не влияют на ресопрягающее действие циклоспорина А. Ресопрягающие эффекты циклоспорина А, карбоксиатрактилата и глутамата аддитивны. Эти соединения, действуя одновременно, способны полностью подавить разобщающую активность лаурата. Сделан вывод, что в митохондриях печени в протонофорном разобщающем действии жирных кислот наряду с ADP/АТР- и аспартат/глутамат-ным антипортерами принимает участие особая система, чувствительная к циклоспорину А, но не связанная с циклофилином D.
Хорошо известно, что свободные длинноцепо-чечные жирные кислоты являются эффективными разобщителями окислительного фосфорили-рования в митохондриях животных и это их действие имеет большое значение в различных физиологических и патологических процессах [1-3]. В митохондриях печени крыс в отсутствие ионов кальция протонофорное разобщающее действие предельных жирных кислот почти на 80% осуществляется при участии белков-переносчиков анионов внутренней мембраны: ЛБР/АТР-антипортера (другое название - переносчик адениннуклеотидов) и ас-партат/глутаматного антипортера [1, 2, 4-6]. Такой вывод сделан на основании данных о способности специфического ингибитора ЛБР/АТР-анти-портера карбоксиатрактилата и субстратов аспартат/глутаматного антипортера глутамата (или аспартата) независимо друг от друга ингибировать разобщающее действие жирных кислот [1, 2, 4-6]. Все еще не ясно, чем обусловлено нечувствительное к влиянию карбоксиатрактилата и глутамата (или аспартата) разобщающее действие жирных кислот, составляющее не менее 20% от их суммарной активности.
Согласно одной из гипотез, участие в разобщении ЛБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипор-теров, а также разобщающего белка из митохондрий бурого жира заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующий перенос недиссоциированной формы кислоты через
фосфолипидный бислой осуществляется без участия белков по механизму флип-флоп [1, 2, 7, 8]. Предполагается, что путь переноса аниона жирной кислоты пролегает в белок-липидной интерфазе, а на середине этого пути имеется специальный сайт с низким сродством к анионам, способствующий транспорту [7, 8]. Из этой гипотезы следует, что гидрофобные соединения, способные взаимодействовать с этим сайтом, но не переносить протон, как, например, алкилсульфонаты [7, 8], могли бы препятствовать разобщающему действию жирных кислот. Наше внимание привлек циклоспорин А - нейтральный липофильный циклический ундеканпептид, хорошо известный как эффективный иммуносупрессор [9]. Циклоспорин А широко применяется при трансплантации органов и при некоторых аутоиммунных заболеваниях [9, 10]. В митохондриях печени млекопитающих циклоспорин А связывается с высоким сродством с пептидил-пролил-цис-транс-изомеразой (другое название - циклофилин Б) [11-13]. Показано, что специфическое взаимодействие циклоспорина А с этим белком препятствует индукции кальций-зависимой неспецифической проводимости внутренней мембраны митохондрий (открытие поры) уже при его концентрации 100-150 пмоль/мг белка [13]. Благодаря этой уникальной способности циклоспорин А часто используется в качестве инструмента при исследовании механизма гибели клеток в связи с индукцией кальций-зависимой неспецифической проводимости внутренней мембраны митохондрий [14, 15]. Циклофилин Б, по-видимо-
Таблица 1. Ингибирование карбоксиатрактилатом и глутаматом стимулированного лауратом дыхания митохондрий печени крыс в отсутствие (контроль) и в присутствии циклоспорина А
Добавки Скорость дыхания, нмоль О2/мин на 1 мг белка
Контроль (n = 4) Циклоспорин А 5 мкМ (n = 4)
А. Без добавок 11.9 ± 0.3 11.8 ± 0.4
Лаур 25.3 ± 0.8 21.7 ± 0.9*
Лаур + Катр 21.4 ± 0.8 17.8 ± 0.6*
Лаур + Катр + Глу 15.7 ± 0.4 11.8 ± 0.4*
Лаур + Катр + Глу + ДНФ 59.3 ± 2.9 52.6 ± 2.7
Б. Без добавок 12.4 ± 0.7 12.2 ± 0.5
Лаур 37.5 ± 1.9 31.3 ± 1.4*
Лаур + Катр 30.9 ± 1.5 24.8 ± 1.3*
Лаур + Катр + Глу 20.8 ± 1.1 14.8 ± 0.7*
Лаур + Катр + Глу + ДНФ 56.2 ± 3.3 49.7 ± 3.0
* Различия между опытом (присутствие циклоспорина А) и контролем (его отсутствие) статистически достоверны, р < 0.05 (критерий Стьюдента).
Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части. Лаур - лаурат, 30 (А) или 60 (Б) мкМ; Катр - карбоксиатрактилат, 1 мкМ; Глу - глутамат, 3 мМ; ДНФ -2,4-динитрофенол, 50 мкМ. Здесь и далее приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего.
му, не единственное место связывания циклоспорина А. В частности, показано, что в митохондриях печени этот пептид в более высокой концентрации ингибирует гидроксилирование холестерина [16]. Очевидно, что, будучи нейтральным липо-фильным соединением, но имея способные формировать водородные связи полярные группы (химическая структура приведена в работе [11]), циклоспорин А мог бы оказывать влияние на перенос через внутреннюю мембрану митохондрий различных липофильных соединений, в том числе анионов свободных жирных кислот.
Целью настоящей работы является выяснение роли циклоспорина А как ресопрягающего агента, способного наряду с карбоксиатрактилатом и глутаматом (или аспартатом) ингибировать протоно-форное разобщающее действие жирных кислот.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Опыты проводили на митохондриях, выделенных из печени белых половозрелых крыс массой 210-250 г общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью свободного от жирных кислот бычьего сывороточного альбумина, как подробно описано ранее [4]. Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при температуре 25°С с помощью кислородного электрода Кларка и полярографа ЬР-9. Среда инкубации содержала 250 мМ сахарозу, 10 мМ сукцинат калия, 0.5 мМ БвТА, 3 мМ М§С12, 0.2 мг/мл
бычьего сывороточного альбумина, 10 мМ 4-мор-фолинопропансульфоновую кислоту - КОН (рН 7.4). При исследовании разобщающего действия лаура-та в полярографическую ячейку сразу после митохондрий (~1.1 мг/мл) добавляли ротенон (2 мкМ) и олигомицин (2 мкг/мл), через 2 мин после этого -лаурат в концентрации 30 или 60 мкМ, а затем с интервалом 1.5 мин - 1 мкМ карбоксиатрактилат и 3 мМ глутамат. Ресопрягающие эффекты карбок-сиатрактилата, глутамата или циклоспорина А выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии пальмитата одним из этих ресопрягающих агентов к величине стимуляции дыхания пальмитатом по формуле 100 х AJJ(Ju - J0), где Ju и J0 - скорости дыхания в присутствии и в отсутствие пальмитата соответственно, AJu - величина снижения скорости дыхания ресопрягающим агентом.
В работе использовали морфолинопропансуль-фоновую кислоту, трис, лауриновую кислоту, олигомицин, сукцинат калия, глутамат калия, карбоксиатрактилат, очищенный от жирных кислот бычий сывороточный альбумин, циклоспорин А ("Sigma", США), ротенон, EGTA ("Serva", Германия), 2,4-ди-нитрофенол, сахарозу ("Fluka", Германия), MgCl2 ("Merck", Германия). Остальные реактивы квалификации х.ч. и ос.ч. произведены в России. Использовали раствор лауриновой кислоты (20 мМ) в дважды перегнанном этаноле.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В табл. 1 приведены результаты исследования влияния циклоспорина А в концентрации 5 мкМ на дыхание митохондрий печени в отсутствие и в при-
сутствии лаурата и при последующем добавлении карбоксиатрактилата и глутамата. Как видно из табл. 1, при окислении сукцината в присутствии ротенона и олигомицина циклоспорин А не влияет на дыхание митохондрий в контролируемом состоянии (в отсутствие синтеза АТР и разобщителей) и при максимальной стимуляции дыхания 2,4-динит-рофенолом. Добавление к митохондриям лаурата в концентрации 30 (табл. 1, А) или 60 (табл. 1, Б) мкМ приводит к увеличению скорости дыхания в 2 и 3 раза соответственно.
В присутствии БвТЛ, ионов магния, ротенона и олигомицина стимуляция дыхания митохондрий жирными кислотами, как сказано ранее [6], обусловлена их протонофорным действием. При этих условиях, как видно из табл. 1, карбоксиатракти-лат и глутамат, добавленные последовательно, снижают стимулированное лауратом дыхание митохондрий, что свидетельствует об их способности ингибировать разобщающее действие этой жирной кислоты, т.е. о ресопрягающем действии. Инкубация митохондрий с циклоспорином А приводит к частичному подавлению стимулированного лауратом дыхания как в отсутствие, так и в присутствии карбоксиатрактилата и глутамата приблизительно на одну и ту же величину (табл. 1). Под влиянием этого пептида карбоксиатрактилат и глутамат снижают скорость дыхания в присутствии 30 мкМ лаурата до величины, определяемой в его отсутствие (табл. 1, А). В тех же условиях, но при увеличении концентрации лаурата до 60 мкМ его разобщающее действие ингибируется не полностью (табл. 1, Б).
В следующих экспериментах (рис. 1) циклоспорин А добавляли к митохондриям после лаурата. Как видно из рис. 1, циклоспорин А одинаково инги-бирует дыхание как в присутствии карбоксиатрактилата и глутамата (рис. 1а), так и в отсутствие этих соединений (рис. 16).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.