МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 55-66
= ОБЗОРЫ
УДК 616.24-006.6-07-036.8-08:577.2:612.118
ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ микроРНК КРОВИ ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО: ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ПРОГНОЗА И ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ
© 2015 г. В. В. Власов1, Е. Ю. Рыкова1* , А. А. Пономарева2, 4, И. А. Запорожченко1, Е. С. Морозкин1, Н. В. Чердынцева2,3, П. П. Лактионов1
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
2 Томский научно-исследовательский институт онкологии, Томск, 634009
3Национальный исследовательский Томский государственный университет, Томск, 634050
4Национальный исследовательский Томский политехнический университет, Томск, 634050
Поступила в редакцию 17.07.2014 г. Принята в печать 13.08.2014 г.
В обзоре освещены методы выделения микроРНК из различных биологических жидкостей организма (в частности, сыворотки и плазмы крови), современные методы исследования концентрации и состава микроРНК и способы нормировки, используемые при анализе/интерпретации данных. Проанализированы преимущества и недостатки описанных методологических подходов. Особое внимание уделено сведениям о циркулирующих в крови микроРНК, которые могут быть использованы в качестве маркеров для малоинвазивной диагностики рака легкого, прогноза течения заболевания и оценки эффективности проводимой терапии. Обсуждаются возможные перспективы и ограничения, возникающие при оценке клинической значимости микроРНК как потенциальных онкомаркеров, а также в ходе формирования четких представлений о роли тех или иных микроРНК в патогенезе рака легкого.
Ключевые слова: рак легкого, диагностика, прогноз, онкомаркеры, циркулирующие микроРНК.
CIRCULATING microRNAs IN LUNG CANCER: PROSPECTS FOR DIAGNOSTICS, PROGNOSIS AND PREDICTION OF ANTITUMOR TREATMENT EFFICIENCY, by V. V. Vlassov1, E. Y. Rykova1*, A. A. Ponomaryova2' 4, I. A. Zaporozhchenko1, E. S. Morozkin1, N. V. Cherdyntseva2' 3, P. P. Laktionov1 ^Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia, *e-mail: rykova@niboch.nsc.ru; 2Tomsk Cancer Research Institute, Tomsk, 634009 Russia; 3National Research Tomsk State University, Tomsk, 634050 Russia; 4National Research Tomsk Polytechnic University, Tomsk, 634050 Russia). The major methods of microRNA extraction from different biological fluids (particularly, serum and plasma), approaches to the analysis of microRNA concentration and composition, normalization methods used in data analysis are outlined in the review. The advantages and disadvantages of the described methodological approaches are being highlighted. Special attention is given to mi-croRNAs, circulating in blood, which could be used as the markers for minimally invasive lung cancer diagnostics, prediction of antitumor treatment efficiency and disease prognosis. Prospects and limitations arising from the evaluation of clinical significance of microRNAs as the potential tumor markers, and emerging as roles of various microRNAs in the pathogenesis of lung cancer become known, are discussed.
Keywords: lung cancer, diagnostics, prognosis, tumor markers, circulating microRNA.
Б01: 10.7868/80026898415010164
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что экспрессия генов регулируется на эпигенетическом уровне. Недавно показано, что ключевыми звеньями регуляции клеточных процессов могут быть некодирующие РНК: малые ин-
* Эл. почта: rykova@niboch.nsc.ru
терферирующие РНК ^РНК), Piwi-взаимодейсту-ющие РНК (р1РНК), микроРНК (шйРНК), длинные некодирующие РНК (1псРНК). К одним из наиболее изученных и распространенных классов некодирующих РНК относятся ш1РНК.
miPHK — класс коротких некодирующих РНК (19—24 н.), играющих важную роль в регуляции многих биологических процессов, таких как клеточный цикл, рост клеток, миграция, апоптоз, дифференцировка и реакция на стресс. По различным оценкам, miPHK могут контролировать экспрессию от 30 до 50% генов человека [1]. miPHK подавляют посттранскрипционную активность посредством связывания с З'-нетранс-лируемыми областями мРНК-мишеней, что приводит к деградации или обратимой инактивации последних. Обнаружены также другие механизмы действия miPHK, не связанные с подавлением транскрипции, например способность miPHK усиливать трансляцию мРНК, а также участвовать в процессе созревания других miPHK [2, 3]. Многие miPHK и даже их семейства высоко консервативны. ^пример, показано, что зрелые формы miPHK из семейства let-7, первый одноименный представитель которого был найден у Caenorhabditis elegans [4], высоко консервативны среди позвоночных, включая человека. Впервые miPHK были обнаружены в 1993 году группой исследователей под руководством Ли (Lee), lin-4 miPHK [5], однако наиболее активные исследования коротких некодирующих PHK начались с 2000 года, после того как обнаружили еще одну miPHK — let-7 — и установили связь между увеличением уровня экспрессии miPHK и развитием злокачественного процесса [6]. В настоящее время miPHK выделяют в отдельный, самый широко представленный на сегодняшний день, класс коротких некодирующих PHK. Согласно последней редакции (июнь 2014 г.), база данных mirbase.org содержит информацию о 35828 зрелых miPHK из 223 видов, 2661 из которых обнаружены у человека.
miPHK считаются одними из ключевых участников патогенеза онкологических заболеваний. Изменение профиля экспрессии miPHK обнаружены при развитии всех злокачественных опухолей, причем miPHK могут выступать как в роли онкогенов, так и опухолевых супрессоров [7]. Pазработка методов, пригодных для выявления рака на ранней стадии по анализу маркеров в крови и других биологических жидкостях представляет важнейшее направление в борьбе с "чумой XXI века". Особенно перспективной считается разработка "жидкой биопсии" на основе циркулирующих в крови внеклеточных нуклеиновых кислот, представленных ДHK, PHK и miPHK. В предлагаемом обзоре обсуждены методологические подходы и результаты исследований профиля циркулирующих miPHK крови при раке легкого, оценка их применимости в качестве диагностических, прогностических и тераностических маркеров.
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ miРНК
Выделение. К настоящему времени разработаны методики выделения т1РНК из различных биологических материалов. При работе с биологическими жидкостями необходима оптимизация этих методов с учетом типа исследуемого образца (плазма, сыворотка крови, моча, бронхиальный смыв и др.). В зависимости от поставленных задач, проводится анализ т1РНК, циркулирующих в сыворотке и/или в плазме крови, при этом оба варианта обладают как преимуществами, так и недостатками в отношении источника т1РНК. При разработке методов количественного извлечения т1РНК из образцов плазмы/сыворотки крови следует учитывать несколько факторов: ферментативная активность нуклеаз крови, форма циркуляции молекул т1РНК, ряд "преанали-тических переменных" (условия обработки крови, стабильность лейкоцитов, эритроцитов крови в процессе обработки, длительность и условия хранения образца плазмы/сыворотки).
Задача выделения т1РНК из биологических жидкостей нуждается в решении трех основных проблем. Во-первых, по данным разных исследований, т1РНК циркулируют в крови как в составе имеющих мембрану везикул (экзосом, микрочастиц) [8, 9], так и в комплексах с белковыми молекулами [10] или липопротеинами [11], и для выделения т1РНК все т1РНК-содержащие комплексы должны быть разрушены. Во-вторых, в плазме крови и других биологических жидкостях наблюдается высокая активность эндогенных РНКаз, которые могут гидролизовать циркулирующие РНК при разрушении нативных комплексов в процессе выделения и/или в результате длительного хранения. И, в-третьих, в биологических жидкостях содержится большое количество белков, липидов и их комплексов, которые связываются с поверхностью адсорбентов, формируют обширные интерфазы и тем самым затрудняют процесс выделения т1РНК. Вот почему оптимальный протокол выделения т1РНК должен удовлетворять следующим условиям: быть нечувствительным к наличию балластных биополимеров, минимизировать действие эндогенных нуклеаз, обеспечивать эффективное разрушение природных т1РНК-содержащих комплексов и, в конечном счете, выделение максимального количества т1РНК, свободной от ингибиторов ферментов, используемых в последующих процедурах.
Несмотря на кажущееся разнообразие доступных методов выделения т1РНК из биологических жидкостей, легко заметить, что подавляющее большинство из них основаны на использовании фенол-гуанидиновой экстракции, предложенной Хомчинским с соавт. [12] еще в 1987 году. Этот
способ позволяет эффективно фракционировать РНК, ДНК и белки, и его принято считать "золотым стандартом качества" выделения РНК. Фенол-гуанидиновый метод с различными модификациями зачастую используют в коммерчески доступных наборах для выделения ш1РНК: TRIzol ("Life Technologies", США); miRVANA ("Life Technologies", США) и др. (табл. 1). Так, например, для очистки и получения обогащенной короткими РНК препаратов miРНК после фенол-гуанидиновой экстракции используются колонки с твердофазными сорбентами ("Qiagen", США) [13].
Метод экстракции РНК в системе фенол-хлороформ-вода широко используется в практике, хотя ему присущ ряд недостатков, таких как длительность и трудоемкость процедуры (проведение экстракции занимает от 40 до 60 мин), использование высокого качества реагентов (в частности, фенола) и, кроме того, эффективность непростой в выполнении процедуры зависит от квалификации исследователя. Использование высокотоксичного фенола требует дополнительного оборудования, рабочих мест и системы утилизации отходов, что осложняет использование этого метода для рутинного выделения miРНК в клинической практике. Альтернативный подход к выделению реализован в наборе miRCURY ("Exiqon", Дания) (табл. 1), в котором вместо трудоемкой процедуры органической экстракции используется денатурация комплексов и осаждение белков и липопро-теинов при помощи запатентованных реагентов, после чего miРНК выделяется из суп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.