УДК 577.112(075.8)
ЦИС- ТРАНС-КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В СРАВНЕНИИ С АНАЛОГАМИ ЖИВОТНОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
© 2014 г. А. Н. Иванкин*, А. В. Куликовский**, Н. Л. Вострикова**, И. М. Чернуха**
*Московский государственный университе леса, Мытищи, Московской обл., 141005
e-mail: aivankin@mgul.ac.ru **Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова,
Москва, 109316 Поступила в редакцию 25.03.2014 г.
Изучены условия образования транс-изомеров жирных кислот в зависимости от способа переработки и хранения сырья микробного, животного и растительного происхождения. Показано, что в составе липидов кроме основного транс-изомера — элаидиновой кислоты, обнаруживаются незначительные количества транс-2-гексен-4-иналя, транс-2-формилциклопропанкарбоксилата, метилоктадека-9-ин-11-транс-еноата, транс-2,2-диметил-1,3-(2-пропенил)этилового эфира, транс-9-октадеценовой кислоты, транс-1,5-гептадиена, а также смешанных изомеров метилоктадека-9-ин-11-транс-еноата, метил-9-цис,11-транс-октадекадиеноата, 1-[транс-4-(2-иод-этил)циклогексил]-транс-4-фенил-цик-логексана и цис-9,транс-11-октадеценовой кислоты. Наибольший по содержанию транс-компонент — элаидиновая кислота содержалась в нативных объектах различного происхождения в количествах, не превышающих 0.05—0.11%. Сочетание температурной обработки с другими параметрами, прежде всего обработки ферментами, приводило к возрастанию доли транс-изомеров, количество которых, как правило, пропорционально срокам хранения материалов.
DOI: 10.7868/S0555109914060051
Природные липиды являются неотъемлемой частью пищевых композиций и необходимы для полноценного функционирования как микро-, так и макроорганизмов. Как известно, 96—98% липидов микробного, животного или растительного происхождения представлены смесью триглице-ридов (ЯОСИ2СИ(ОЯ)СИ2ОЯ) с Я-алифатиче-скими остатками предельных, моно- и полиненасыщенных жирных кислот [1, 2]. Жирные кислоты с несколькими двойными химическими связями, которые способны проявлять эффект цис-изоме-рии, в наибольшей степени подходят для формирования биологических структур [3, 4].
Все основные природные ненасыщенные жирные кислоты имеют, как правило, цис-форму. Наличие транс-форм в общей массе липидов может указывать на патологию развития организма или неправильную переработку сырья [5].
Установлено, что присутствие транс-изомеров в питании живых существ существенно ухудшает его качество. Признано, что их доля в пище млекопитающих не должна превышать уровень в 2%, однако Комитет ВОЗ рекомендовал полностью исключить транс-изомеры из продуктов питания, как вещества, способствующие развитию сердечно-сосудистых заболеваний [6, 7].
В настоящее время исследования в данной области сосредоточены на выявлении конкретных
форм транс-изомеров в объектах различного происхождения, а также определении условий их возникновения [8—12].
Было показано, что кроме чистых транс-форм в нативных липидах при определенных условиях обнаруживаются смешанные цис- и транс--жир-ные кислоты, доля которых может существенно возрастать под действием различных факторов [13-15].
Для организации питания важно изучение цис-транс изомерии жирных кислот, поскольку в большинстве исследований указывается на целесообразность полного исключения транс-изомеров из состава продуктов пищевого назначения [16].
Цель работы — оценка реального естественного содержания транс-изомеров жирных кислот в составе некоторых природных липидов, а также определение влияния различных факторов in vivo и in vitro на скорость их образования.
МЕТОДИКА
В качестве биомассы использовали клетки штамма E. coli JM 109 (ATCC 35218), генотип которого описан в литературе [17—19].
Культивирование продуцента проводили в питательной среде, содержащей (г/л): казеин-пеп-
тон — 20, дрожжевой экстракт — 14, К2НР04 — 6, КН2Р04 - 3, NaCl - 5, MgS04 - 0.5, исходный рН 6.8. Посевную культуру выращивали в колбах Эрленмейера емкостью 0.75 л, содержащих по 0.15 л указанной среды, в которую дополнительно однократно вносили по 10 мл стерильного 20%-ного раствора глюкозы [20].
Колбы с инокулированной средой инкубировали на качалке "Infers RC-TK" (Швейцария), дающей 200 об/мин, в течение 18 ч, при 37°С до достижения оптической плотности культуральной жидкости при 546 нм в 8 раз по сравнению с исходной средой. Выращенную посевную культуру использовали для засева питательной среды в 10 л ферментере "Анкум 2М" (Россия) (коэффициент заполнения 0.6). Количество посевного материала составляло 10 об. % от объема ферментера. Температура культивирования - 37°С, расход воздуха - 2 л/мин л среды, скорость вращения мешалки 300 об/мин. Значение рН 6.5-6.8 поддерживали добавлением стерильного 10%-ного раствора глюкозы и 25%-ного раствора аммиака. Для интенсификации роста культуры параллельно проводили выращивание в присутствии 0,1 г/л гамма-аминомасляной кислоты (ГАМ). Выращенные клетки отделяли центрифугированием при 3000 g и получали биомассу влажностью 75%, с содержанием белка 16.8% (по Лоури), липидов -2.2%, которые для исследований экстрагировали по Фолчу [21].
Животные липиды (1.9-2.4%) экстрагировали из длиннейших мышц (Longissimus dorsi) пятигодовалых свиней породы Ландрас, выращенных по стандартной технологии. Параллельно с контрольной группой, в корм опытной группы вводили гормональный эстрогенный регулятор диэтилстиль-бэстрол (ДЭС) из расчета 30 мг/кг массы животного. Масса опытных животных на 14-21% превосходила массу контрольных.
Растительные липиды получали из семян зрелого подсолнечника (Helianthus annus, сорт Альбатрос) с длительностью вегетационного периода 85 сут и урожайностью 30 ц/га. Контрольные семена выращивали естественным путем без применения удобрений, опытные растения еженедельно подкармливали смесью мочевины, нитрата кальция, суперфосфата и диаммофоски (по 10 г/м2), в которую добавляли 0.05 мг/г интенсификатора герматранола (1-гидроксигермантрана моногидрат C6H15N05Ge, ГГМ). Семена содержали 5254% масла, которое отжимали на прессе при комнатой температуре и давлении 5 МПа.
Липиды подвергали воздействию липаз. Для этого использовали панкреатин с активностью липазы 0.7 ед./мг и протеазы 40 ед./мг. Панкреатин получали трехкратной экстракцией свиной поджелудочной железы ацетоном (1 : 1) при 0°C с последующей сушкой под вакуумом. Очищенная
микробная липаза (КФ 3.1.1.1) из Candida rugosa L8525-1MU фирмы "Sigma" (США) с молекулярной массой 52 кДа имела активностью липазы 15 ед./мг и протеазы <0.05 ед./мг [22]. Перед использованием панкреатической липазы суспензию фермента дополнительно активировали прогреванием в течение 1 ч при 50°C по методу [23, 24].
Энзиматическую трансформацию жирных кислот осуществляли путем обработки 10%-ной водной эмульсии смеси липида и гексана (1 : 1) в течение 4 ч при 40—55°C в присутствии 1% липазы к массе жирового компонента по методу [25]. Выход транс-жирных кислот определяли после 6 ч гидролиза.
Для анализа отбирали пробы и определяли в них содержание транс-изомеров. Кинетические кривые рассчитывали с применением методов математической статистики по формулам, описанным в работах [26, 27].
Энергию активации процесса гидролиза определяли по уравнению Аррениуса [26]: k = = kQexp(—E/RT), где kQ — предэкспоненциальный множитель, E — энергия активации, R — газовая постоянная, Т — абсолютная температура.
Состав жирных кислот анализировали на газовом хроматографе 7890А с масс-селективным детектором 5975C VLMSD ("Agilent Technologies", США). Образцы (от 1 до 10 г) обрабатывали модифицированным методом Фолча смесью 10 мл хлороформа и 10 мл метанола в присутствии 1%-ного раствора KCl в течение 3—24 ч для растворения ли-пидных компонентов. Экстракт фильтровали через бумагу, и после удаления избытка растворителей упаривали досуха и подвергали кислотному гидролизу для получения смеси метиловых эфиров кислот, которые анализировали на капиллярной колонке HP-Innowax 30 м х 0.32 мм х 0.5 мкм в газовом хроматографе 7890А ("Agilent Technologies"). Условия хроматографии: повышение температуры колонки в термостате от 100°C до 260°C со скоростью Ю^/мин; температура инжектора 250°C, детектора 300°C; скорость потока водорода из генератора — 35 см3/мин; потока азота — 20 см3/мин; деление потока 1 : 100; время анализа 30 мин; объем пробы — 1 мкл. Гидролиз 0.01 г липидов проводили в 3 мл 15%-ного раствора ацетилхлорида в метаноле при 100°C в течение 2 ч с последующей нейтрализацией смеси до рН 5.0—6.0 насыщенным раствором КОН в метаноле (1.25 мл). Затем к смеси добавляли 3 мл насыщенного водного раствора NaCl и 3 мл гексана, инкубировали несколько минут и отбирали на анализ 0.2 мкл прозрачного гек-санового слоя, содержащего метиловые эфиры жирных кислот. Для расчета содержания изомеров использовали автоматическую базу поиска и идентификации данных хроматомасс-спектрометрии NIST08 MS Library c вероятностью соотнесения пиков более 65% [http://www.nist.gov/srd/nist1a.cfm].
Для количественного определения использовали стандартные растворы смеси метиловых эфиров С4—С24 жирных кислот в метаноле № 47885U "Supelco" (США), содержащей 10 мг/мл: масляной (С4:0) капроновой (С6:0), каприловой (С8:0), каприновой (С10:0), деценовой (С10:1), ундециловой (C11:0), лауриновой (С12:0), триде-кановой (C13:0), миристиновой (С14:0), мири-столеиновой (цис-9-тетрадеценовой С14:1), пен-тадекановой (C15:0), цис-10-пентадеценовой (C15:1), пальмитиновой (С16:0), пальмитолеино-вой (цис-9-гексадеценовой С16:1), маргариновой (С17:0), цис-10-гептадеценовой (С17:1), стеариновой (С18:0), олеиновой (цис-9-октадеценовой C18:1n9c), элаидиновой (транс-9-октадеценовой C18:1n9t), линолевой (цис-9,12-октадекадиеновой С18:2п6), гамма-линоленовой (цис-6,9,12-окта-дектриеновой С18:3п6), альфа-линоленовой (цис-9,12,15-октадектриеновой С18:3п3), нонде-кановой (С19:0), арахиновой (С20:0), гадолеино-вой (цис-9-эйкозеновой С20:1п9), цис-11,14-эй-козадиеновой (С20:2п6), цис-8,11,14-эйкозатрие-новой (С20:3п6), цис-11,14,17-эйкозатриеновой (С20:3п3), арахидоновой (цис-5,8,11,14-эйкоза-тетра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.