БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, там 40, № 1, с. 57-62
УДК 546.221.1:591.88:595.24 МОРФОЛОГИЯ
ЦИСТАТИОНИН р-СИНТАЗА И ЦИСТАТИОНИН у-ЛИАЗА В ТКАНЯХ НЕМЕРТИНЫ CEREBRATULUS MARGINATUS RENIER, 1804 (NEMERTEA)1
© 2014 г. А. В. Чернышев12, Е. П. Коцюба1
'Институт биологии моря -им. А.В. ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690041;
2Далъневосточный федералъныйуниеерситет, Владивосток 690600 e-mail: nemertea@fromru.com
Статья принята к печати 6.06.2013 г.
С помощью методов иммуногистохимии изучено распределение ферментов синтеза сероводорода (H2S) цистатионин Р-синтазы (CBS) и цистатионин у-лиазы (CSE) в тканях немертины Cerebratulus marginatus Renier, 1804 (Heteronemertea: Lineidae). Экспрессия как CBS, так и CSE обнаружена в стенке тела и в рецепторных клетках каналов церебральных органов, CBS - в передней и средней кишке, a CSE - в мозге, боковых нервных стволах и церебральных органах. Обсуждаются особенности распределения и возможная функциональная роль H2S-синтезирующих элементов у немертин.
Ключевые слова: сероводород, цистатионин Р-синтаза, цистатионин у-лиаза, немертины.
Cystathionine p-synthase and cystathionine y-lyase in tissues of the nemertean Cerebratulus marginatus Renier, 1804 (Nemertea). A. V. Chernyshev12, E. P. Kotsyuba1 (A..V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041; 2Far Eastern Federal University, Vladivostok 690600)
Using immunohistochemistry, we have examined the distribution of the hydrogen sulfide (H2S) synthesizing enzymes cystathionine P-synthase (CBS) and cystathionine y-lyase (CSE) in tissues of the nemertean Cerebratulus marginatus Renier, 1804 (Heteronemertea: Lineidae). The expression of both CBS and CSE was found in the body wall and in the receptor cells of the canals of the cerebral organs; the expression of CBS, in the foregut and intestine; CSE, in the brain, lateral nerve cords, and cerebral organs. The peculiarities of distribution and the possible functional role of H2S-synthesizing elements in nemerteans are discussed. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. l,pp. 57-62).
Keywords: hydrogen sulfide, cystathionine B-synthase, cystathionine y-lyase, nemerteans.
Сероводород (H2S) - один из газообразных нейро-трансмитгеров, участвующих во многих физиологических и патологических процессах в организмах позвоночных животных и человека (Abe, Kimura, 1996; Wang, 2002; Boehning, Snyder, 2003). Эндогенно H2S синтезируется из L-цистеина преимущественно пиридоксаль-5'-фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин Р-синтазой (CBS, ЕС 4.2.1.22) и цистатионин у-лиазой (CSE, ЕС 4.4.1.1).
Первое доказательство существования сигнальной системы сероводорода у беспозвоночных животных было получено после обнаружения высоких концентраций H2S и сульфидов в органах и тканях морских беспозвоночных Ruditapes philippinarum, Arenicola marina (Julián et al., 2002) и Mercenaria mercenaria (см.: Gainey, Greenberg, 2005). Сравнительно недавно получены данные о наличии эндогенного синтеза H2S в нервной системе некоторых членистоногих (Watanabe et al., 2006; Коцюба, 2012). Несмотря на то, что роль H2S у беспозвоночных животных мало изучена, имеющиеся сведения свидетельствуют об участии серово-
дорода в механизмах обучения и памяти (Watanabe et al., 2006) и в защитных реакциях (Budde, Roth, 2010). Экспериментально также установлено, что при воздействии экзогенного H2S увеличивается продолжительность жизни у нематоды Caenorhabditis elegans (см.: Miller, Roth, 2007).
Однако до сих пор не ясно, насколько древней в филогенетическом отношении является сигнальная система сероводорода и обязательна ли она для представителей относительно низкоорганизованных беспозвоночных животных. Тип немертины (Nemertea) - филогенетически древняя группа Trochozoa (или Lophotrochozoa), морфологически обособленная как от плоских червей, так и от аннелид. Изучение нового класса регуляторных систем, так называемых газообразных посредников, у немертин начато сравнительно недавно. В настоящее время активно исследуются распределение и функциональная значимость оксида азота (Зайцева и др., 2009), но сведения о наличии Н28-синтезирующих структур у представителей данной группы беспозвоночных в литературе отсутствуют.
1 Работа выполнена при частичном финансировании Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях (Договор № 11.G34.31.0010), а также грантов ДВО РАН № 12-Ш-В-06-090 и РФФИ № 13-04-01664.
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение распределения CBS и CSE в тканях немертины Cerebratulus marginatus Renier, 1804.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на немертине Cerebratulus marginatus (Heteronemertea: Lineidae); животных собирали на глубине 5-8 м в зал. Восток (Японское море) в сентябре 2012 г.
Для иммунохимического выявления Н28-синтезирующих структур немертин фиксировали целиком в течение 2 ч в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0.1 M фосфатном буфере (pH 7.2) при 4°С. После промывки в фосфатном буфере их помещали на 1 сут в холодный 30% раствор сахарозы на 0.1 M фосфатном буфере.
Цистатионин ß-синтазу выявляли по стандартной методике на срезах толщиной 30-35 мкм, приготовленных на замораживающем микротоме и смонтированных на предметных стеклах. После ингибирования эндогенной пероксидазы в 1% растворе Н202 и подавления неспецифического связывания антител в 1% нормальной сыворотке срезы инкубировали с моноклональными антителами против CBS (Abeam, Великобритания) (разведение 1 : 500) в течение 18 ч при 4°С. Затем срезы промывали в нескольких сменах 0.1 M фосфатно-солевого буфера (PBS) (pH 7.2) и инкубировали 2 ч в растворе вторичных биотинилированных антител (Vector Labs, США) в разведении 1 : 200. После промывания срезы инкубировали с авидин-биотин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Labs, США) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте, затем их трижды промывали в PBS. Продукты реакции визуализировали при помощи субстрата (VIP Substrate Kit, Vector Labs, США), контролируя процесс окраски под микроскопом. После этого срезы обезвоживали по стандартной методике и заключали в канадский бальзам.
Для идентификации структур, содержащих цистатионин у-лиазу, срезы инкубировали с поликлональными антителами против CSE (Santa Crus Biotechnology, Inc., США) (разведение 1 : 500) в течение 18 ч при 4°С. После промывки в трех сменах PBS срезы инкубировали в растворе вторичных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом (FITC, 1 : 400) (Santa Crus Biotechnology, Inc., США) в течение 2 ч в темноте при 4°С. Затем их промывали PBS и заключали в 1% раствор глицерина. В контрольных экспериментах первичные антитела заменяли эквивалентным количеством 1% неиммунной сыворотки. Во всех контрольных экспериментах иммунопозитивная реакция не обнаружена. Препараты фотографировали на инвертированном микроскопе с флуоресцентным модулем Axiovert 200 M.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Цистатионин ß-синтаза
У исследованной немертины Cerebratulus marginatus CBS-иммунореактивность обнаружена в стенке тела, передней и средней кишке, маркировались также клетки, выстилающие канал церебрального органа.
В стенке тела большая часть CBS-иммунореак-тивных клеток выявлена в эпидермисе. Они локализовались преимущественно в верхней части эпителиального пласта одиночно или небольшими группами (рис. 1А, В). Многие клетки, относящиеся к открытому типу, имели удлиненно-овальную или веретеновидную форму. Их длина варьировала от 7 до 20 мкм, ширина - от 3
до 6 мкм. Количество СВ8-позитивных клеток в разных участках эпителия кожно-мускульного мешка немертин существенно различалось. Наибольшее количество клеток маркировалось в передне- и среднелатеральных частях тела (рис. 1А), немного меньше - в головном отделе (рис. 1Б), а наименьшее количество - в заднелатераль-ной части тела (рис. 1В).
В кутисе наиболее интенсивно окрашивались многочисленные СВ8-иммунореактивные волокна, которые образовывали сплетения. В основном они локализовались в передней части тела, преимущественно в головном отделе (рис. 1Г). Некоторые маркированные волокна, по-видимому, являлись отростками СВ8-позитивных клеток эпидермиса и/или кутиса. Помимо волокон в кутисе под эпителием обнаружены одиночные клетки округлой или грушевидной формы размером от 10 до 18 мкм (рис. 1Д). Их отростки прослеживались иногда до дистальной части кутиса.
В пищеварительной системе СВ8-иммунореактив-ные клетки выявлены в основном в передней кишке, которая у исследованного вида немертины представлена только желудком (рис. 1Е). В переднем отделе желудка количество СВ8-иммунореактивных элементов было значительно больше, чем в заднем (рис. 1Ж). В средней кишке маркировались лишь единичные клетки. В желудке и средней кишке СВ8-иммунореактивные клетки округлой или овальной формы и размером от 8 до 12 мкм обнаружены преимущественно в гастроэпидермисе (рис. 13). У большинства этих клеток тонкий отросток, направленный к просвету пищеварительного тракта, достигал поверхности эпителия. Под эпителием СВ8-иммунореактивные элементы не обнаружены.
Положительная реакция на СВ8 была отмечена также в клетках, выстилающих каналы церебральных органов (рис. 1Ж).
Цистатионин у-лиаза
С8Е-иммунореактивные клетки и волокна выявлены в мозге, боковых нервных стволах, церебральных органах и стенке тела немертины С. таг^т^ш.
В мозге С8Е-иммунореактивность отмечена преимущественно в вентральных ганглиях (рис. 2А). В боковых нервных стволах наиболее интенсивное свечение нейронов и нервных волокон наблюдалось сразу позади вентральных ганглиев, оно постепенно снижалось по ходу нервных стволов до уровня перехода желудка в среднюю кишку (рис. 2Б). В дистальной части нервных стволов специфическое свечение отсутствовало. Характерная особенность С. тащта1ж - интенсивное свечение волокон в нейропилях боковых стволов при относительно малом числе мелких (размером около 10 мкм) С8Е-иммунореактивных нейронов в области клеточных тел (рис. 2А, Б).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.