БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 1, с. 13-22
УДК 547.466.964:542.95
ЦИСТЕИНСОДЕРЖАЩИЕ ПЕПТИДЫ ВЫЗЫВАЮТ МИГРАЦИЮ МОНОЦИТОВ © 2015 г. М. В. Сидорова*, Т. И. Арефьева, М. П. Палькеева, А. С. Молокоедов, А. А. Азьмуко,
Н. Ю. Рулева, Е. А. Пылаева, Т. Л. Красникова, |Ж. Д. Беспалова
ФГБУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс"Минздрава РФ, 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., 15а Поступила в редакцию 08.04.2014 г. Принята к печати 07.07.2014 г.
Твердофазным методом с использованием Fmoc-технологии проведен синтез ряда цистеинсодержащих линейных фрагментов моноцитарного хемотаксического белка-1 и хемокинового домена фракталкина и их аналогов, в которых остаток цистеина был модифицирован или заменен остатком серина. На основе линейных предшественников получены химерные молекулы — симметричные или несимметричные дисульфиды. Изучено влияние синтезированных соединений на клеточную подвижность in vitro. Показано, что пептиды, стимулирующие миграцию моноцитов, содержат в своем составе остаток цистеина со свободной тиольной группой. Пептиды с блокированной SH-группой цистеина, с заменой остатка цистеина на серин, а также дисульфидные химерные молекулы хемокинетическими свойствами не обладают.
Ключевые слова: моноцитарный хемотаксический белок-1, фракталкин, миграция лейкоцитов, пептидный синтез, дисульфидная связь.
DOI: 10.7868/S0132342315010121
ВВЕДЕНИЕ
Настоящая работа является продолжением наших исследований по поиску и синтезу пептидных фрагментов хемотаксических цитокинов (хемоки-нов), влияющих на миграцию лейкоцитов [1, 2]. В качестве объектов для изучения нами были выбраны моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и фракталкин, которые вызывают привлечение моноцитов в очаги воспаления и повреждения тканей и играют существенную роль как в патологических процессах, обусловленных воспалением, так и в процессах репарации [3—5]. Фракталкин является мембраносвязанным гликопротеидом. Хе-мокиновый домен фракталкина (CDF), обладающий хемоаттактантными свойствами, высвобождается из клеточной мембраны путем протеолиза [6]. Ранее нами были синтезированы и изучены в экспериментах in vitro и in vivo пептиды, соответствую-
Сокращения: Acm — ацетамидометил; CCR2 — рецептор МСР-1; CDF — хемокиновый домен фракталкина (chemokine domain of fracktalkine); DBU — 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен; DTT — дитиотреит; Fmoc — 9-флуоренилметоксикарбо-нил; HOBt — 1-гидроксибензотриазол; MALDI — матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация; МСР-1 — моноцитарный хемотаксический белок-1 (monocyte chemoat-tractant protein-1); 4-MePip — 4-метилпиперидин; NMM — Л-метилморфолин; NADPH — никотинамидадениндинук-леотидфосфат; Nox — NADPH-оксидаза; TBTU — тетрафтор-борат 2-( 1Д-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния; Pbf — 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил; PT — коклюшный токсин Pertussis toxin; TIS — триизопропил-силан; Trt — тритил; АФК — активные формы кислорода; ФБ — фосфатный буфер.
#Автор для переписки (тел.: +7 (495) 414-67-16, факс: +7 (495) 414-67-86, е-mail: peptide-cardio@yandex.ru).
щие различным участкам аминокислотных последовательностей МСР-1 и CDF. Были найдены как ингибиторы (пептиды МСР-1-(65-76), МСР-1-(53-60) и CDF-(60-71)), так и активаторы миграции клеток (фрагменты МСР-1-(29-40) и CDF-(41-52)) [1, 2]. Свойства стимулирующего миграцию моноцитов пептида МСР-1-(29-40) были проанализированы нами в моделях воспаления и заживления ран у экспериментальных животных. Показано, что при локальном введении пептид вызывает привлечение моноцитов, стимулирует образование грануляционной ткани вокруг инородного материала и ускоряет заживление ран [7].
Моноциты играют существенную роль в репарации миокарда. В первые часы и сутки после инфаркта миокарда в зону повреждения мигрируют моноциты, экспрессирующие рецептор МСР-1 CCR2, функцией которых является удаление некротической ткани. Затем в миокард поступают моноциты, экспрессирующие рецептор фракталкина CX3CR1, которые участвуют в стимуляции ангиогенеза и образования внеклеточного мат-рикса [8]. В модели ишемии-реперфузии миокарда у крыс было обнаружено, что внутрисердечное введение пептида МСР-1-(29-40) в момент перевязки левой коронарной артерии сопровождается привлечением моноцитов в первые сутки после вмешательства. В отдаленные сроки — на 28-е сутки — количество немиоцитарных клеток в около-рубцовой зоне снижается [9]. Полученный результат может свидетельствовать о кардиопротекторном действии пептида при инфаркте миокарда.
Особенностью хемокинов является наличие в их структуре в определенных положениях остатков цистеина, соединенных дисульфидными связями [5]. Известно, что дисульфидные мостики в белках выполняют разные функции: участвуют в повышении термодинамической стабильности белковых глобул, определяют механические свойства внеклеточных белков, тиол—дисульфидный обмен может лежать в основе регуляции ферментативной активности и т.п. [10]. Создание молекул, содержащих связанные природной дисульфидной связью линейные пептидные фрагменты из разных доменов белка с известной или предполагаемой биологической активностью, является современным подходом к моделированию биологических функций белков.
Задачами данного этапа исследований являлось изучение механизмов стимулирующего действия пептида МСР-1-(29-40) на клеточную подвижность и поиск более эффективных стимуляторов клеточной подвижности. С этой целью мы получили химерные молекулы на основе пептидов МСР-1-(29-40) и CDF-(41-52), а также пептидов из других участков хемокинов и оценили их влияние на миграцию моноцитов in vitro.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В молекуле хемокина МСР-1 дисульфидная связь замкнута между остатками Cys11 и Cys36, в молекуле CDF S—S-мостиком соединены остатки Cys12 и Cys50 [5]. Пептиды МСР-1-(29-40) (II) и CDF-(41-52) (IV) содержат по одному из остатков цистеина, участвующих в образовании соответствующих S—S-мостиков. Нами были синтезированы
дополнительно цистеинсодержащие пептидные фрагменты МСР-1-(7-18) (I) и CDF-(6-17) (III) и получены химерные молекулы (V)—(VIII), представляющие собой симметричные и несимметричные дисульфиды, построенные на основе линейных предшественников. Был также получен линейный гибрид (IX), в котором фрагменты МСР-1-(29-40) и CDF-(41-52) последовательно соединены амидной связью. Соответствующие структуры приведены в табл. 1. Кроме того, были синтезированы аналоги пептидных фрагментов МСР-(29-40) и CDF-(41-52), в которых сульфгидрильная группа цистеина была блокирована — пептид (X), либо вообще отсутствовала в молекулах аналогов (XI) и (XII) (табл. 1) благодаря замене Cys на Ser. Для твердофазного синтеза линейных пептидов (I)—(IV), (IX)-(XII) была выбрана наиболее современная Fmoc-методо-логия. Полученные пептиды очищали с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Структуру пептидов подтверждали данными 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а их чистоту — данными аналитической ВЭЖХ. Характеристики синтезированных пептидов и полученных на их основе надмолекулярных конструкций приведены в табл. 1.
Синтез симметричных дисульфидов (V) и (VII) на основе линейных пептидных фрагментов хемокина МСР-1 был проведен в водной среде с использованием перекиси водорода при рН 7.5—8.0 [11] с достаточно высокими для подобных соединений выходами — 75 и 49% соответственно. Ниже представлена принципиальная схема синтеза симметричных и несимметричных дисульфидов.
(II)
29
29
>и
(PyS)2
36 40 |h2Q2, pH 8
36
40
(V)
29 36 40
Симметричный дисульфид MCP-1-(29-40) MCP-1-(29-40)
Симметричный дисульфид MCP-1-(7-18)
MCP-1-(7-18)
7 11 18
(VII)
18
H2O2, pH 8
(I)
29
NH4OAc, pH 8 36 40
(VI)
7 11 18
Несимметричный дисульфид MCP-1-(7-18) MCP-1-(29-40)
Схема. Синтез симметричных (V), (VII) и несимметричного (VI) дисульфидов на основе линейных фрагментов хемокина МСР-1.
S
Таблица 1. Характеристики синтезированных пептидов и их влияние на миграцию лейкоцитов
Пептид Структура пептида Обозначение пептида M paoici. Выход (%) ВЭЖХ MAFDI-MS (m/z) Миграция моноцитов**
Rt (мин) чистота (%)
(I) H-Ala-Pro-Val-Thr-Cys-Cys(Acm)-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-OH МСР-1-(7-18) 1459.4 27.4 14.7 95 1459.8 "+"
(II) H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH МСР-1-(29-40) 1375.6 36<a> 10.34 97.7 1376.6
(Ш) H-Thr-Lys-Cys(Acm)-Asn-Ile-Thr-Cys-His-Lys-Met-Thr-Ser-OH CDF-(6-17) 1437.6 34.8 10.6 98 1437.8
(IV) H-Leu-Glu-Thr-Arg-Gln-His-Arg-Leu-Phe-Cys-Ala-Asp-NH2 CDF-(41-52) 1487.2 32.2 14.3 96 1487.6
(V) H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-iys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH МСР-1-(29-40) МСР-1-(29-40) 2749.2 74.8® 12.02 98.0 2748.7, 1375.8* ii ??
(VI) H-Ala-Pro-Val-Thr-Cys-Cys(Acm)-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-OH 1-1 H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH МСР-1 -(7-18) МСР-1-(29-40) 2833.0 46.8® 13.7 95 2832.4 ii ??
(VII) H-Ala-Pro-Val-Thr-Cys-Cys(Acm)-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-OH H-Ala-Pro-Val-Thr-(tys-Cys(Acm)-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-OH МСР-1-(7-18 IVlCP-l-(7-18) 2916.8 48.7 16.2 95 2916.6 ii ??
(VIII) H-Thr-Lys-Cys(Acm)-Asn-Ile-Thr-Cys-His-Lys-Met-Thr-Ser-OH 1-1 H-Leu-Glu-Thr-Arg-Gln-His-Arg-Leu-Phe-Cys-Ala-Asp-NH2 CDF-(6-17) CDF-(41-52) 2922.8 48.7 12.8 95 2922.7 ü ??
(IX) H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala—Leu-Glu-Thr - -Arg - Gin - His - Arg - Leu-Phe-Cys - Ala - Asp -NH2 МСР-1-(29-40)-CDF-(41-52) 2869.3 22.0^ 12.8 90 2868.4, 2890 [M+Na], 2906.4 [M+K], "+"
(X) H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys(CH2CONH2)-Pro-Lys-Glu-Ala-OH [ Cys36( CH2CONH2) ] MCP-l-(29-40) 1432.7 82® 9.76 97.6 1433.2 ii ??
(XI) H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Ser-Pro-Lys-Glu-Ala-OH [Ser36]MCP-l-(29-40) 1359.6 78(a) 9.22 98.0 1359.8 ii ??
(XII) H-Leu-Glu-Thr-Arg-Gln-His-Arg-Leu-Phe-Ser-Ala-Asp-NH2 [Ser50]CDF-(41-52) 1471.2 71.8 15.3 97 1472.0 ii ??
а Выходы пептидов приведены в расчете на стартовую аминокислоту, присоединенную к полимеру. 6 В расчете на исходные компоненты реакции.
* m/z соответствует молекулярной массе дочернего пептида, входящего в состав дисульфида. ** Знаком "+" помечены пептиды, стиму
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.