УДК 576.3.08
ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ДОФАМИНА КАК СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ГЛОБУЛЯРНОГО АКТИНА
В ЦИТОЗОЛЕ ЖИВЫХ КЛЕТОК
© 2012 г. Е. Ю. Парнышкова1*, В. П. Лавровская1, Л. Л. Павлик1, Э. И. Лежнев1, 2, Д. А. Мошков1, 2**
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Московская обл.; электронная почта: *scroll_live@rambler.ru, **d_moshkov@mail.ru 2Пущинский государственный университет, 142290, Пущино, Московская обл.
Поступила в редакцию 05.07.2011 г.
После доработки 01.11.2011 г.
Оценили возможность выявлять глобулярный (Г-) актин в цитозоле клеток микроскопическими методами, в частности, для обнаружения малигнизированных клеток, главный цитопатологиче-ский признак которых — аномально высокое содержание Г-актина в цитозоле. Клетки одного происхождения, но с разным состоянием цитозольного актина в них, после инкубации в течение 40 ч в среде культивирования, содержащей дофамин (ДА), изучали с помощью цитохимической реакции на биогенные амины по методу Фалька. Клетки линии BALB/3T3 clone A31 эмбриона мыши использовали в качестве нормальных клеток с дифференцированным актиновым цитоскелетом, а такие же клетки, но зараженные патогенным вирусом SV-40, линии 3T3B-SV40, использовали в качестве малигнизированных, их цитозоль состоит преимущественно из Г-актина. Выявлено многократное усиление флуоресценции цитозоля и кариоплазмы, мест с наибольшей концентрацией Г-актина, в малигнизированных клетках по сравнению со здоровыми. Таким образом, показано, что Г-актин опухолевых клеток является диагностической мишенью дофамина, который проникает, как ранее установлено, в цитозоль и полимеризует Г-актин, встраиваясь как интегральный компонент в нити в соотношении 100 : 1, и одновременно люминесцентно метит Г-актин благодаря превращению в изохинолин в реакции с формальдегидом. Отмечена цитотоксичность дофамина, существенно снижающего жизнеспособность опухолевых клеток. Предположено, что содержание Г-актина в цитозоле клеток можно количественно оценивать, инкубируя их в среде с дофамином и определяя интенсивность флуоресценции в цитозоле.
Ключевые слова: культура клеток BALB/3T3 clone A31 и 3T3B-SV40, дофамин, жизнеспособность, флуоресцентная микроскопия, реакция Фалька.
Актин, главный компонент цитоскелета, рассматривают как основной белок цитоскелета любой живой эукариотической клетки. Составляя 5—15% всего клеточного белка, актин присутствует в клетках в двух формах — филаментозной (Ф) и глобулярной (Г) [1]. Актин поддерживает морфологию клеточных отростков, ламеллоподий, филоподий, клеточных специализированных контактов, организует внутриклеточную и межклеточную сигнализацию [2—8]. Для визуализации в клетках Ф-актина разработаны разнообразные микроскопические приемы [9—12], такие как декорирование микрофиламентов фрагментом 81 миозина, окрашивание фаллоидином, меченным флуорохромами или коллоидным золотом [13], иммунофлуоресцентное мечение [14]. Идентификация, тем более количественная, хотя бы и косвенная, Г-актина внутри клеток такими способами практически невозможна. Между тем,
именно Г-актин служит субстратом для непрерывного формирования Ф-актина при функционировании клеток. Изменения в распределении Г- и Ф-актина тесно связаны с различными клеточными процессами, происходящими при повреждении и движении клеток, воздействии биологических, химических и физических факторов и адаптации к ним, малигнизации, нарушении перехода одной формы актина в другую, и фатальны для клетки [15]. В частности, при малигнизации клеток основу цитозоля составляет Г-ак-тин, неспособный полимеризоваться, формировать прочные межклеточные контакты и цитоскелет, в результате чего клетки становятся мягкими, лабильными, способными к инфильтрации и метастазированию [16, 17]. Поэтому крайне необходимо выявлять такие изменения. Мы предположили, что для косвенной оценки содержания Г-актина в цитозоле можно использо-
вать воздействие дофамина (ДА) на клетки, а затем цитохимически (с помощью флуоресцентной микроскопии) визуализировать этот катехоламин методом Фалька. Предпосылкой для таких исследований стали результаты изучения взаимодействия ДА с живыми клетками и с модельными системами, полученные в лаборатории в последнее время [18]. Установлено, что ДА прямо взаимодействует с цитозольным Г-актином, превращая его в Ф-актин, и встраиваясь при этом как интегральный компонент в индуцированные актино-вые нити в соотношении 100 : 1 [18, 19]. Это позволяет визуализировать именно Г-актин по люминесценции молекул дофамина, встроенных в нити вместе с молекулами Г-актина, используя для этого реакцию Фалька, а по интенсивности свечения судить о его количестве. Изучение взаимодействия ДА с культивируемыми клетками показало, что выращенные в суспензии клетки окрашивались более интенсивно, чем клетки, распластавшиеся на субстрате [20], что объясняется большим содержанием Г-актина в цитозоле [21]. По-видимому, по интенсивности люминесценции клеток можно косвенно судить о количестве Г-актина в цитозоле. Сходные различия в соотношении Г- и Ф-актина наблюдаются и в случае нормальных и опухолевых клеток, у которых актин находится в основном в Г-форме. В силу комплексных нарушений он не может полимери-зоваться, а, следовательно, формировать прочные контакты и стресс-волокна, что и делает эти клетки способными к инфильтрации и метаста-зированию. Для подтверждения возможности использовать ДА в качестве средства для визуализации и косвенной количественной оценки содержания Г-актина в живой клетке необходимо изучить взаимодействие ДА с клетками одного происхождения, но с разным состоянием цито-зольного актина в них, что и было целью нашей работы. В представленной работе изучено действие ДА на две культуры клеток, связанные общим происхождением, но качественно различные по свойствам.
с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина (80 мкг/мл). Дофамин (ДА, Orion, Pharma, Финляндия) в конечной концентрации 1.0 х 10-3 и 1.0 х 10-4 M вносили в клеточную суспензию одновременно с посевом (до распластывания клеток на дне чашки). Чтобы исключить побочный эффект окисления ДА в культуральную среду добавляли антиоксидант — метабисульфит натрия (200 мкМ) [22]. Через 40 ч после посева по степени заполнения (%) поверхности дна чашки Петри монослоем (конфлуент-ности) оценивали жизнеспособность клеток по ранее описанной методике [20]. Для традиционного микроскопического исследования препараты фиксировали в тех же сосудах, в которых культивировали клетки, по одной из двух методик (с использованием в качестве раствора для фиксаторов культуральной среды или буфера), принятых в нашей лаборатории [23], обезвоживали в растворах спиртов возрастающей концентрации и заливали в эпоксидную смолу Эпон-812. Клетки изучали непосредственно в залитом монослое, расположенном на дне чашки Петри, с помощью просвечивающего светового микроскопа NU-2E (Carl Zeiss, ФРГ), снабженного цифровой фотокамерой Nikon CoolPix 995 (Япония). Цитохимическую реакцию на биогенные амины проводили по модифицированному методу Фалька [24], для чего после инкубации клеток с ДА неприкрепленные клетки осаждали центрифугированием, осадок трижды отмывали от ДА ресуспендированием в чистом буферном растворе (PBS). Промытые клетки наносили в виде мазка на предметное стекло, мазки высушивали в течение 2 сут над концентрированной серной кислотой и нагревали до 80°C над параформальдегидом в течение 1 ч. Изохинолины, образовавшиеся в процессе конденсации катехоламинов и паров формальдегида, визуализировали по флуоресценции при 490—500 нм (^ex = 330, 375 нм). Использовали микроскоп AXIO Imager Z1 (Carl Zeiss), любезно предоставленный В.А. Яшиным (ИБК РАН). Мы благодарны ему также за помощь при проведении съемки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали культуру клеток линии BALB/3T3 clone A31 эмбриона мыши — нормальных клеток со свойственной им дифференциров-кой актинового цитоскелета, и культуру клеток линии 3T3B-SV40, зараженных вирусом SV-40, в результате чего клетки приобретали малигнизи-рованный фенотип и теряли способность формировать дифференцированный цитоскелет. Обе культуры получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали в чашках Петри (5 мл, 37°C, 5% CO2) в среде, содержащей RPMI-1640 и DMEM в соотношении 1 : 1
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Наблюдения за состоянием культуры клеток после инкубации в течение 40 ч в среде, содержащей дофамин (ДА), показали, что ДА оказывал на клетки цитотоксическое действие, пропорционально усиливающееся с увеличением его концентрации (рис. 1). Видно, что количество контрольных клеток прогрессивно возрастает, достигая через 40 ч максимального значения, 100%-го заполнения монослоем всей поверхности дна чашки Петри. Культивирование клеток обеих линий в среде, содержащей ДА в концентрации 1 х 10-4 М, вызывает ослабление их роста, в 2 раза более выраженное у культуры опухолевых клеток 3Т3В-8У40,
ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ДОФАМИНА
211
100
я
1 ^
4 S
ост
5 °
а
^ *
ьр
не ев по
в с
Ст
80
60
40
20
BALB/3T3 40 ч 3T3 B-SV40 40 ч
0 10-4 М 10-3 М
Концентрация дофамина, М
Рис. 1. Влияние дофамина на выживаемость культуры клеток BALB/3T3 clone A31 и 3T3B-SV40 после инкубации в течение 40 ч.
0
чем у ее нормального прототипа BALB/3T3 clone A31 (конфлуентность 40 и 80% соответственно). Воздействие на клетки ДА в концентрации 1 х 10-3 М оказывало еще больший негативный эффект. И в этом случае цитотоксический эффект ДА на клетки 3T3B-SV40 был более выраженным, чем на клетки BALB/3T3 clone A31. Выживаемость опухолевых клеток спустя 40 ч, судя по значениям конфлуентности, составила 2% , что в 5 раз ниже, чем у нормальных клеток в этих условиях (степень заполнения 20%). Жизнеспособность нормальных клеток под воздействием ДА снижалась в 5 раз по сравнению с контролем, а опухолевых клеток — в 50 раз.
При визуализации биогенных аминов c помощью реакции Фалька в клетках, культивируемых в среде, содержащей ДА, выявлено многократное усиление флуоресценции цитозоля и кариоплазмы, м
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.