ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 3, с. 323-331
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
цитокинин вызывает дифференциальную регуляцию экспрессии конструкций pahk-gus в трансгенных растениях
Arabidopsis thaliana © 2012 г. М. Н. Данилова, Н. В. Кудрякова, Н. К. Зубкова, В. В. Кузнецов, О. Н. Кулаева
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 11.07.2011 г.
Изучена регуляция цитокинином экспрессии генетических конструкций: Pahk2-GUS, Pjhk^3-GUS и Pahk4-GUSу трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, содержащих ген ß-глюкуронида-зы (GUS ген) под контролем промотора одного из трех генов, кодирующих гистидиновые протеин-киназы, которые являются мембранными рецепторами цитокинина. У этиолированных 4-5-дневных проростков A. thaliana наиболее высокая активация экспрессии экзогенным цитокинином отмечена для конструкций PahktGUS и Pah^3-GUS. Эти же конструкции активировались цитокинином и при переходе проростков от скотоморфогенеза к фотоморфогенезу. При длительном культивировании в темноте на среде, содержащей цитокинин, существенно возрастала активность промотора гена, кодирующего гистидинкиназу AHK2. В листьях трехнедельных растений, имеющих активно функционирующие хлоропласты, обработка цитокинином в большей степени стимулировала экспрессию конструкции Pahk3-GUS. В срезанных стареющих листьях экзогенный цитокинин замедлял потерю хлорофилла, но не вызывал достоверных изменений активности GUS как на свету, так и в темноте ни у одной из линий, содержащих в геноме GUS ген под контролем промоторов гистидиновых киназ. Вместе с тем, наблюдалась активация цитокинином промотора гена первичного ответа на цитокинин в конструкции Parr-GUS. Таким образом, в изученной тест-системе в ходе темнового и светового развития растений A. thaliana в ответ на обработку цитокинином наблюдалась дифференциальная экспрессия генов гистидиновых киназ, которая определялась возрастом, условиями культивирования и физиологическим состоянием растений.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana — хлорофилл — цитокинин — гистидинкиназа - трансформанты — ß-глюкуронидаза
ВВЕДЕНИЕ
Цитокинины (ЦК), как и другие растительные гормоны, являются одними из важнейших индукторов регуляторных сигналов, контролирующих разнообразные аспекты роста и развития растений. Известно, что цитокинины необходимы для деления клеток, прорастания семян, дифферен-цировки побегов, задержки старения и ответов на стресс [1-4]. Им принадлежит важная роль в контроле формирования корневой системы и активации светорегулируемых процессов, таких как дифференциация хлоропластов [5, 6] и деэтиоля-ция [7, 8, 9].
Системы восприятия, передачи и реализации цитокининовых сигналов являются предметом интенсивных исследований на протяжении последних 20 лет. Согласно устоявшимся представлениям, первая стадия в рецепции ЦК сигнала
Сокращение: ЦК — цитокинины.
Адрес для корреспонденции: Кудрякова Наталия Васильевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-80-18; электронная почта: nkudryakova@rambler.ru
осуществляется мембранными гистидиновыми протеинкиназами [10, 11]. Они воспринимают сигнал внешнего и, по-видимому, внутреннего по отношению к клетке ЦК, и передают его через фосфатный каскад в ядро на ЦК-специфичный транс-фактор ЛЯЯ типа В [12], который, в свою очередь, активирует гены первичного ответа на ЦК ЛЯЯ типа А, что обеспечивает негативную регуляцию ответа клеток растения на ЦК [13]. Данная сигнальная система участвует в регуляции многих морфофизиологических программ. В исследованиях с использованием дрожжевой двух-гибридной системы было обнаружено более 100 белков-партнеров, взаимодействующих с компонентами гистидинкиназной регуляторной системы [14].
У Л. АаНапа рецепторы ЦК образуют мульти-генное семейство, представленное тремя членами: ЛНК2, ЛНК3 и ЛНК4 (или СЯЕ1) [15]. Гены-ортологи гистидиновых киназ рецепторов ЦК были идентифицированы также у кукурузы (гтИК2, гшИКЗа, гтИК4), риса (ОНК2, ОНКЗ, ОНК4, ОНК5), СаЛагаШНт тзет (СгСКЯ1), Ьыр1-
nus albus (LaHK1), Medicago truncatula (MHK2, MHK3, MtCRE1), Medicago sativa (MsHK1) и Lotus japonicus (LHK1), однако их функциональная роль изучена недостаточно [3]. У A. thaliana физиологическую функцию рецепторов ЦК анализировали, главным образом, методами обратной генетики, т.е. оценивали фенотип мутантов с выключенными генами гистидиновых киназ и их ответ на различные воздействия [15-17]. Исследование подобных мутантов показало, что наряду со значительной генетической избыточностью члены мультигенного семейства рецепторов ЦК демонстрируют определенную специфичность в различных органах и на разных стадиях онтогенеза [16, 17]. Таким образом, данная тест-система оказалась очень информативной для идентификации морфофизиологических ответов, контролируемых рецепторами ЦК, хотя анализ экспрессии генов на модифицированном генетическом фоне может давать искаженную картину взаимодействия членов сигнальных цепей в регуляции множества важнейших реакций растения.
Важным является исследование формирования рецепторной системы цитокининов в онтогенезе растений и влияния на нее внутренних и внешних факторов. Сведения в этой области не достаточны. Так, известно, что экспрессия генов AHK2, AHK3 и AHK4 происходит в 5-дневных проростках Arabidopsis с низкой активностью по всему растению [15]. При этом в корнях преобладает экспрессия гена AHK4, а в побегах AHK2 и AHK3 [16]. Преимущественное накопление тран-скриптов наблюдается в меристеме стебля и корня и в сосудистой системе всего растения [15].
Особый интерес представляет вопрос о влиянии ЦК на формирование своей рецепторной системы. Данные об этом отрывочны и малочисленны. Слабое влияние цитокининов на экспрессию генов CRE1/AHK4 выявлено на проростках Arabi-dopsis [2].
Регуляция экспрессии генов мембранных рецепторов ЦК с помощью цитокинина не обнаружена в 5-дневных проростках Arabidopsis, как при коротком (15 мин), так и при более длительном (2 ч) в действии гормона [18]. Однако снижение уровня транскриптов гена AHK4 у CKX1 трансформантов Arabidopsis, обедненных ЦК, позволяло предполагать их участие в активации экспрессии гена AHK4 [18]. Наиболее убедительно это показано в работе Che с соавт. [19], в которой перенос эксплантов корней Arabidopsis на богатую ЦК среду, индуцирующую стеблевой морфогенез, приводило к существенному увеличению экспрессии AHK4. Тем не менее, вопрос об экспрессии генов цитокининовых рецепторных киназ в онтогенезе растений и о действии ЦК на экспрессию генов своих рецепторов, а также о влиянии
на их экспрессию внешних факторов остается слабо изученным.
Удобной моделью для оценки регуляции ЦК экспрессии генов рецепторных гистидиновых ки-наз являются генно-модифицированные растения, включающие репортерный ген под контролем промотора одной из трех гистидиновых киназ A. thaliana. Результаты, полученные с применением таких конструкций, позволяют судить о регуляции экспрессии генов, кодирующих каждый из мембранных рецепторов ЦК и в ходе развития растений, и при действии внешних факторов.
Цель нашего исследования заключалась в том, чтобы изучить регуляцию ЦК экспрессии генов гистидиновых киназ: AHK2, AHK3 и AHK4, о которой судили на основе измерений активности репортерного GUS гена, на различных этапах развития растений в условиях морфогенеза в темноте и на свету. Регуляцию ЦК экспрессии GUS гена под контролем промоторов рецепторных гисти-диновых киназ сопоставляли с действием ЦК на экспрессию GUS гена, находящегося под контролем промотора гена первичного ответа на цито-кинин ARR5.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали трансгенные растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (экотипы Wassilews-kja и Columbia), включающие бактериальный ген ß-глюкуронидазы под контролем промоторов генов одной из трех гистидиновых протеинкиназ (Pahk2-GUS, PHK3-GUS и PAHK4-OUS), а также промотора гена регулятора ответа типа А (PARR5-GUS). Семена трансформантов были любезно предоставлены проф. С. Nishimura (Университет На-гойи, Япония) и проф. J.J. Kieber (Университет Северной Каролины, США).
Для синхронизации прорастания семена инкубировали на воде при 4°C в течение трех суток, а затем высевали в почву или чашки Петри на ага-ризованную питательную среду МС, приготовленную в соответствии с прописями Nishimura с соавт. [15]. В ряде опытов среда для выращивания включала также синтетический аналог природного цитокинина 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 10-6 M. Растения выращивали в климатической камере при температуре 23°C в темноте или на свету (270 мкмоль/(м2 с)) при продолжительности светового периода 16 ч. Подробное описание постановки экспериментов приводится в подписях к рисункам.
Измерение активности ß-глюкуронидазы проводили флюорометрическим методом, согласно Jefferson с соавт. [20], используя флюориметр Hoefer DyNA Quant 200 ("Amersham Biosciences", Великобритания). Растворимый белок определяли бицинхониновым методом в модификации
Stocheck [21]. Содержание хлорофилла измеряли в соответствии с методом Arnon [22], используя спектрофотометр Genesys 10UV ("Thermo Electron Corporation", США).
Все эксперименты проводили не менее трех раз при трех биологических повторностях. На графиках приведены средние значения и стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В условиях скотоморфогенеза, т.е. в ходе развития растений в темноте, 4-5-дневные этиолированные проростки A. thaliana, выращенные на среде без ЦК, имели значения активности конструкции PAHK2-GUS (рис. 1а) примерно в 2 раза выше, чем зеленеющие (рис. 1б) или выращенные на свету зеленые проростки (рис. 1в).
Уровень активации этой конструкции экзогенным ЦК в целых проростках достигал величины порядка 160% и не зависел от условий выращивания. Активность GUS при экспрессии конструкции PAHR3-GUS во всех вариантах опыта была примерно одинакова, как и активация промотора AHK3 экзогенным ЦК, которая составляла около 140% (рис. 1). Активность конструкции PHK4-GUS в данном эксперименте была очень низкой и не з
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.