ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2008, том 55, № 6, с. 842-850
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ЦИТОКИНИН-ЗАВИСИМАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЛЯЯ5::Ои8-КОНСТРУКЦИИ В ХОДЕ РОСТА ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЙ Arabidopsis thaliana
© 2008 г. В. Ю. Штратникова*, О. Н. Кулаева**
*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва **Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 29.04.2008 г.
Изучали рост и активность глюкуронидазы (GUS) в семядолях и розеточных листьях растений Ara-bidopsis thaliana (L.) Heynh. (экотип Wassilewskija), трансформированных G^S-геном под контролем цитокинин-зависимого промотора ARR5 гена. По активности GUS судили о присутствии в растениях активных форм цитокининов. Растения выращивали в течение 3 нед. на питательной среде с нитратом или аммонием. Рост семядолей и листьев растений при аммонийном питании был существенно снижен по сравнению с растениями, получавшими нитраты. Этому соответствовала значительно меньшая активность GUS в листьях растений на среде с аммонием, что указывало на сниженное содержание в них активных форм цитокининов, способных активировать промотор ARR5 гена. У листьев растений, росших на обоих источниках азота, активность GUS увеличивалась в ходе их роста и резко снижалась после его прекращения, что свидетельствовало о зависимости роста листьев от их обеспеченности цитокининами. Высокая активность GUS, обнаруженная в черешке и проводящей системе листа, указывала на снабжение листьев цитокининами из корней по сосудистой системе. Резкое падение активности GUS после прекращения роста нижерасположенного листа совпадало по времени с увеличением активности GUS в вышерасположенном листе. Это указывало на возможное перераспределение в растении цитокининов, содержание которых могло быть лимитирующим фактором роста листа. Существенная активация роста листьев растений на нитратном источнике азота и соответствующая этому высокая активность GUS в листьях обсуждается с
точки зрения сигнальной роли цитокининов в регуляции роста листьев с помощью N O3.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana - цитокинины - нитраты - аммоний - рост листа - ARR5-ген - активность GUS.
ВВЕДЕНИЕ
Цитокинины принимают участие в регуляции жизни растения на всех этапах онтогенеза от оплодотворения яйцеклетки до старения и смерти. Они участвуют в регуляции деления клеток, дифференцировке хлоропластов, индуцируют стеблевой морфогенез, задерживают старение листьев, участвуют в регуляции транспорта метаболитов в растении; с их помощью корневая система регулирует функциональную активность в надземных органах, в частности, в листьях [1, 2].
Наиболее изученный путь передачи цитоки-нинового сигнала осуществляется по принципу
Сокращения: ARR-гены - гены регуляторов ответа, GUS -
ß-глюкуронидаза. Адрес для корреспонденции: Кулаева Ольга Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: okulaeva@mail.ru
двухкомпонентной регуляторной системы. У растений Arabidopsis thaliana она включает мембранные рецепторные гистидинкиназы, воспринимающие цитокининовый сигнал и передающие его с помощью фосфатного каскада в ядро, где происходит индукция цитокинин-зависимых генов [3-6]. К их числу относятся гены первичного ответа на цитокинины, которые кодируют регуляторы ответа ARR (от Arabidopsis response regulator) типа А. Гены ARR типа А являются генами прямого ответа на цитокинин. Их индукция не нуждается в предварительном синтезе белка и осуществляется через несколько минут после предоставления цитокинина [7-9]. Экспрессия ARR-генов типа А под действием цитокинина высокоспецифична и не вызывается другими фито-гормонами [10]. У A. thaliana гены ARR типа А представлены семейством из 10 генов. Они кодируют перекрывающиеся по функциям негативные регуляторы ответа растения на цитокинин [11]. Для осуществления этой функции требуется фосфорилирование белков ARR типа A [12, 13].
В лаборатории проф. J. Kieber [9] создана генетическая конструкция с использованием промотора АК^5-гена - одного из генов семейства ARR типа А, - под который поставлен маркерный ген Р-глюкуронидазы (GUS) Escherichia coli. Это позволяет проводить гистохимическое определение активности ARR5 промотора, что широко используется при изучении особенностей его активности [14, 15].
Быстрота и высокая специфичность индукции цитокинином гена ARR5 позволили Aloni с соавт. [15] использовать экспрессию гена GUS под контролем промотора ARR5-гена в растениях A. thaliana, трансформированных генетической конструкцией ARR5::GUS для оценки содержания в тканях активных форм цитокининов. Авторы подтвердили правомерность такого подхода, показав соответствие интенсивности активности GUS и содержания в растениях цитокининов, которые определяли с помощью специфических моноклональных антител [15].
Мы использовали предложенный Aloni с соавт. [15] подход для оценки содержания активных форм цитокининов в ходе роста трансформированных ARR5::GUS-конструкцией растений A. thaliana.
Наша задача состояла в том, чтобы изучить, как содержание активных форм цитокининов коррелирует с ростовыми процессами в надземных органах растений A. thaliana в раннем периоде их развития (до 3 нед.). Для получения контрастных по ростовым характеристикам растений их выращивали на питательных средах с нитратным или аммонийным источниками азотного питания, поскольку известно, что это приводит к существенным различиям роста растений [16-18].
Сравнение экспрессии GUS-гена под контролем промотора ARR5-гена в растениях на нитратной и аммонийной формах азотного питания было интересно еще и потому, что нитрат индуцирует синтез цитокининов, активируя экспрессию генов изопентенилтрансфераз [19-21]. О влиянии аммония на синтез цитокининов известно далеко не достаточно [21]. Поэтому сравнительный анализ содержания активных форм цитокининов в растениях A. thaliana, получавших аммонийное и нитратное питание, представлял особый интерес.
МЕТОДИКА
Выращивание растений. В работе использовали растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (экотипа Wassilewskija), трансформированные конструкцией, содержащей бактериальный ген Р-глюкуронидазы (GUS) под контролем цитоки-нин-зависимого промотора ARR5-гена [9]. Семе-
на трансгенных растений были любезно предоставлены проф. J. Kieber (Университет Северной Каролины, США).
Семена стерилизовали отбеливателем с содержанием активного хлора 7% в течение 8 мин и промывали трижды стерильной водой по 5 мин. Затем семена помещали в пластиковые чашки Петри (с диаметром 10 см) на агаризован-ную питательную среду МС с половинной концентрацией минеральных солей. Среды содержали в качестве единственного источника азота 20 мМ KNO3 или 10 мМ (NH4)2SO4. Для выравнивания содержания калия и одновалентных отрицательных ионов в аммонийную среду добавляли 10 мМ KCl. После инкубации при 4°С в течение трех дней чашки Петри с семенами переносили в климатическую камеру, и растения выращивали при освещении 120 мкмоль фото-нов/(м2 с), температуре 23°С и продолжительности светового периода 16 ч. Наблюдения проводили в течение 3 нед. Пробы растений отбирали дважды в неделю.
Определение активности GUS. Для проведения GUS-реакции растения помещали в 0.05 М натрий-фосфатный буфер, pH 7.0, содержащий 1 мМ X-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил^-Б-глю-куронид), 0.2% Тритон X-100, 0.5 мМ K3Fe(CN)6, 0.5 мМ K4Fe(CN)6, и выдерживали при 37°С в течение суток [22, 23]. Удаление хлорофилла проводили 70% этанолом и при необходимости дополнительной обработкой 30% раствором молочной кислоты. Образцы хранили в 70% этаноле.
Растения фотографировали под бинокулярной лупой Stemi 2000 ("Carl Zeiss", Германия) с помощью фотоаппарата Canon PS G6 и программы ZoomBrowser EX (Canon). Фотографии растений с окрашенным в синий цвет продуктом GUS-реакции переводили в черно-белое изображение (8-битная цветопередача), и интенсивность окраски количественно оценивали с помощью программы ImageJ. Результаты приведены в условных единицах (0-255) по системе HSV компьютерной графики, представляющих собой среднюю интенсивность окраски на единицу проанализированной площади. Активность GUS измеряли в пластинках и черешках семядолей и розеточных листьев, а также в гипокотилях. Измерения проводили в сосудистой системе и в мезофилле базальной, центральной и апикальной частей семядолей и листьев. За базальную часть листа принимали часть листовой пластинки от ее нижнего края до вторых жилок второго порядка. За апикальную часть листа принимали участок листовой пластинки от ее верхнего края до верхних жилок второго порядка. Остальную часть листа рассматривали как центральную.
Морфологические измерения. Площадь листьев и семядолей, длину черешков и гипокотиля
£ 70
5 60
00 50 £
О 40 л
В 30 о
g 20 я
Ё 10
<
0
35 30 -
Контроль
-7
БАП, lg[C]
Рис. 1. Зависимость активности GUS в листьях Arabi-dopsis thaliana от логарифма концентрации БАП (M) в среде инкубации листьев.
Столбиком показан уровень активности GUS в контрольных листьях, выдержанных сутки на дистиллированной воде.
измеряли на фотографиях растений с использованием программы ImageJ.
На графиках представлены средние значения из двух характерных экспериментов, с 2-3 биологическими повторностями в каждом; бары на графиках обозначают среднюю ошибку (n = 5).
Реактивы. X-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил-P-D-глюкуронид) фирмы "Acros Organics" (США), Тритон Х-100 фирмы "Serva" (Германия), все остальные реактивы заводов "Реахим" (Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как показали Aloni с соавт. [15], активность GUS в растениях A. thaliana, трансформированных генетической конструкцией, содержащей GUS-ген под контролем цитокинин-зависимого промотора, позволяет судить о содержании в тканях активных форм цитокининов. Чтобы проверить возможность использования такого подхода в условиях наших экспериментов, срезанные листья первого яруса двухнедельных растений помещали на растворы БАП различной концентрации и затем измеряли в листьях активность GUS. БАП является физиологически высо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.