БИОХИМИЯ, 200б, том 71, вып. 12, с. 1613 - 1617
УДК 577.124
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПОЛИСАХАРИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВОДОРОСЛЕЙ, НА HL60 КЛЕТКИ
© 2006 г. К. Куэроз1, К. Ассис2, В. Медейрос2, Х. Роша1, Х. Аояма1, К. Феррейра2, Е. Лете1*
1 Department of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte, 59082-970 Natal, Rio Grande do Norte, Brazil; fax: (5584)321-19208
2 Department of Biochemistry, State University of Campinas 13083-970 Campinas, Sao Paulo, Brazil; fax: (5584)211-9208, E-mail: eddaleite@cb.ufrn.br
Поступила в редакцию 07.04.06 После доработки 30.06.06
Целью данного исследования было изучение цитотоксического влияния на клетки HL60 трех различных классов полисахаридов из водорослей. Среди полисахаридов галактофуканы, фукоидан и глюкан. Жизнеспособность клеток оценивали по реакции с участием MTT, содержанию белка и фосфатазной активности. Показано повышение фосфатазной активности и содержания белка, связывание MTT в присутствии трех типов галактофуканов (1, 2 и 3), имеющих молекулярные массы 1600, 1200 и 360 кДа соответственно. Однако, в присутствии галактофукана 3 общее количество белка не менялось. При равных экспериментальных условиях с другими галактофуканами для галактофукана 3 наблюдалось резкое повышение фосфатазной активности. Усиление функции митохондрий наблюдалось у клеток, находящихся в контакте с галактофука-ном 1. Фукоидан не оказывал существенного влияния на связывание MTT, однако приводил к понижению содержания белка (IC50 около 30 мкг/мл). Глюкан также способствовал активации всех вышеуказанных параметров, особенно фосфатазной активности и содержания белка. Данная работа содержит новые знания о цитотоксическом действии полисахаридов на клетки HL60, а также предпосылки о роли фосфатазы в данном процессе.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фукан, глюкан, клетки HL60, цитотоксичность, водоросли.
Существенный интерес к полисахаридам вызван их различного рода биологической активностью: антикоагулянтной, антитромботи-ческой, противовоспалительной, антивирусной, иммуностимулирующей и противоопухолевой [1—3]. Полисахариды характеризуются высокой биосовместимостью и низкой токсичностью. Известность сульфатированных полисахаридов, таких как фукоидан и фуканы, обусловлена их связыванием с различными белками внеклеточного матрикса и клеточных структур в силу полианионного характера. Такие полисахариды, состоящие в основном из сульфатированной Ь-фукозы, могут быть легко выделены из клеточных стенок бурых водорослей (к примеру, РНаворНуевае). Они могут состоять более чем на 40% из клеточных стенок [3, 4]. В последнее время интерес к сульфатированным фуканам осо-
Принятые сокращения: МТТ — 3-(4,5-диметилтиа-зол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид, п-НФФ — па-ра-нитрофенилфосфат, п-НФ — пара-нитрофенол.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
бенно возрос в связи с поиском новых лекарственных средств. В их структуру входит не только фукоза, но и множество других сахаров, таких как галактоза, манноза, ксилоза, уроновая кислота и в некоторых случаях даже белки [5, 6]. Данные полисахариды можно подразделить на гомофуканы (фукоиданы) и гетерофуканы. Фу-каны участвуют в различных биологических процессах и присутствуют в организмах, принадлежащих к самым различным таксонам. Недавно фуканы были найдены у иглокожих [7]. Фуканы вовлечены в различные клеточные процессы, такие как миграция, адгезия, рост и апоптоз [3, 8].
Р-1люканы состоят из линейных или же слабо разветвленных полисахаридов, представляющих Р-Б-глюкопиранозные остатки, связанные 1^3-связями. Нейтральные гликаноподобные полимеры могут быть использованы для модификации с целью получения биологического ответа. К примеру, рецепторы лимфоцитов и макрофагов, преимущественно дектин-1 и СЯ3, способны распознавать этот класс полисахаридов [9].
1613
1614
КУЭРОЗ и др.
Клеточная линия HL60 была выделена в 1977 году у пациента с острой миелоидной лейкемией. Клетки HL60 используются в качестве модельных. Они сыграли ключевую роль в изучении роста и видоизменений лейкемий человека [10]. Данные клетки во многом схожи с промоелоци-тами, постоянно растущими в суспензионной культуре, что может привести, в конечном счете, к клеточной дифференциации in vitro. Клетки HL60 — хорошо изученная модель для изучения влияния различных физиологических и фармакологических агентов на развитие и рост клеток [11-13].
В последнее время было разработано большое количество методов определения токсичности различных веществ in vitro. Терапевтическое и токсикологическое действие вещества являются важными параметрами для подтверждения его применения в фармакологии. Основная цель настоящего исследования заключается в оценке цитотоксического влияния выделенных из водорослей полисахаридов на клетки HL60 по следующим параметрам: реакция с MTT, содержание белка и фосфатазная активность.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. Фукоидан из Fucus vesiculosus (гомофукан) — фирмы «Sigma», (США). Глюкан и галактофуканы из морских водорослей Lobophora variegata были разделены гель-фильтрацией с использованием в качестве носителя Сефарозы CL-4B. Галактофуканы 1, 2 и 3 (1600, 1200 и 360 кДа соответственно) были получены в соответствии с методом, указанным в работе [14]. Химические анализы были проведены как описано в работе [15].
Культура клеток. Клетки HL60 (ATCC) выращены в среде RPMI 1640, содержавшей 2 мМ L-глутамина, антибиотики (1000 ед. пенициллина/мл, 100 мкг стрептомицина/мл) и 10% термо-инактивированной эмбриональной бычьей сы-
воротки. Клетки росли во влажной атмосфере, содержащей 5% С02 при 37°. Клетки помещали в 24-луночный планшет (плотность клеток 3 х 105 клеток/мл), через 72 ч обрабатывали полисахаридами (конечная концентрация 5—50 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч.
Анализ цитотоксичности. Реакция МТТ: среда, содержавшая полисахариды была удалена, и в каждую лунку добавили 1 мл раствора МТТ (0,5 мг МТТ на 1 мл клеточной среды). После 4 ч инкубации при 37° среда была удалена, и образовавшиеся кристаллы формазана растворили в 1 мл этилового спирта. Абсорбция полученных растворов была измерена при длине волны 570 нм после встряхивания планшета в течение 5 мин на планшетном шейкере [16].
Измерение фосфатазной активности. Фермент был выделен после клеточного лизиса в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,5. Реакционная смесь (конечный объем 1 мл) содержала 0,1 М ацетатный буфер, рН 5,5, 5 мМ п-НФФ и экстрагированный фермент. Количество образовавшегося п-НФ определяли по поглощению при 405 нм [17].
Определение количества белка. Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури [18].
Статистический анализ данных. Каждое экспериментальное значение было получено в результате трех независимых измерений. Средние и стандартные отклонения были определены с помощью ANOVA и Т-теста.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице представлены химический состав и молекулярная масса полимеров. Для разных полисахаридов применяли различные относительные соотношения сахаров. В частности, содержание галактозы в галактофуканах выше, чем других моносахаридов, тогда как фукоза содержится во всех полисахаридах, кроме глюка-
Химический состав и молекулярные массы выделенных из водорослей полисахаридов
Образец Полисахариды (%) М.М. (кДа) Фукоза Галактоза Глюкоза SO3Na
Галактофукан 1 45,7 1600 1 3 1,50
Галактофукан 2 62 1200 1 3 — 2,10
Галактофукан 3 55 390 1 3 — 2,30
Фукоидан 64 170 1 — 1,70
Глюкан 77,5 11 — — 1 —
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ПОЛИСАХАРИДОВ
1615
на. Галактофуканы различаются по молекулярным весам (1600, 1200 и 390 кДа), как показано с помощью гель-проникающей хроматографии. Глюкоза не содержится в галактофуканах, что указывает на отсутствие ламинаранов (группа скрытых в-Б-глюканов, найденных в бурых водорослях). В препаратах полисахаридов отсутствовали альгиновая кислота и белки (данные не представлены), что указывает на чистоту полученных препаратов. В состав галактофуканов 1, 2 и 3 входят сульфатные группы, а степень сульфатирования составляет 23,3, 30,4 и 35,5% соответственно (таблица). Другой полисахарид, фукоидан, представляет собой сульфатирован-ный гомофукан, с высоким содержанием суль-фатированной фукозы. Структура фукоидана была изучена Патанкаром с соавт. [1]. Результаты химического анализа фукоидана, полученные нами находятся в хорошем соответствии с данными вышеуказанной работы.
В настоящей работе представлены предварительные результаты изучения цитотоксического влияния выделенных из водорослей глюканов на клетки НЬ60. Полисахариды глюканы найдены в клеточных стенках растений, грибов и бактерий. Сотни статей, посвященных глюканам, отражают большой научный интерес к этим полисахаридам. Проведенная нами характеристика глюканов, использованных в данной работе, показала, что полисахариды обладают хорошей растворимостью в воде, содержат только глюкозу, имеют молекулярную массу 11 кДа и не содержат белков и других сахаров (таблица).
Цитотоксический эффект полисахаридов был изучен, принимая во внимание параметры, связанные с различными условиями клеточного метаболизма. К примеру, реакция с МТТ дает информацию о функции митохондрий. Содержание белка пропорционально числу клеток, а фосфатазная активность указывает на функции клеточного обмена, а именно на пути метаболизма фосфата [19, 20].
Фосфатазы связаны с различными сигнальными путями. Эти ферменты могут влиять на клеточный рост и естественную смерть клетки [10]. По активности данных ферментов можно судить о жизнеспособности клеток [16]. Фосфа-тазы могут также быть вовлечены в процесс клеточной дифференциации [11].
При повышении концентрации галактофу-канов было показано усиление фосфатазной активности, связывание МТТ и увеличение количества белка (рис. 1, а, б и в). В то же время для галактофукана 3 наблюдался резкий рост фос-фатазной активности, тогда как количество белка не менялось. Функция митохондрий усиливалась в наибольшей степени в случае галакто-
250
200
150
100
50
0
б 160
140
) 120
сЬ 100
>
ъ 80
ia
> 60
el
о 40
20
0
200
150
100
50
- Protein -Phosphatase MTT
10 20 30 4
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.