МЕДИЦИНСКИЕ = ПОЛИМЕРЫ
УДК 541(64+57)
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ НЕЗАРЯЖЕННЫХ АМФИФИЛЬНЫХ СОПОЛИМЕРОВ1
© 2012 г. О. А. Будкина, Т. В. Демина, Т. Ю. Дородных, Н. С. Мелик-Нубаров, И. Д. Гроздова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Химический факультет 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3 Поступила в редакцию 27.12.2011 г.
Принята в печать 16.03.2012 г.
На культурах клеток исследована токсичность 16 амфифильных незаряженных полимеров, включая триблок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида (плюроники), полиглицерины (блок-сополимеры этиленоксида, пропиленоксида и глицерина), чередующийся и диблок-сополимеры диме-тилсилоксана и этиленоксида, а также углеводородсодержащие полиэтоксилированные ПАВ (Тритон Х-100 и Бридж-35). Сопоставление цитотоксических концентраций полимеров и их ККМ показало, что Тритон Х-100, Бридж-35 и чередующийся сополимер этиленоксида и диметилсилоксана токсичны для клеток в концентрации ниже ККМ. В отличие от них все исследованные блок-сополимеры становились токсичными при концентрации выше ККМ, т.е. проявляли цитотоксичность только в мицеллярной форме. Обнаружено, что молярная концентрация блок-сополимера, при которой гибнет 50% клеток (ЕС50), зависит от гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) его молекулы и описывается следующим эмпирическим уравнением: ЕС50 х 106 = 8.71 х ГЛБ21. Обнаруженная зависимость позволяет предсказать диапазон концентраций блок-сополимера, при которых он токсичен для клеток в культуре.
ВВЕДЕНИЕ
Амфифильные неионные ПАВ, такие как по-лисорбат-80, Твин-80, Кремофор ЕЬ (полиэток-силированное касторовое масло), а также незаряженные триблок-сополимеры этиленоксида (ЭО) и пропиленоксида (ПО) типа ЭОиПОтЭОи, выпускаемые под коммерческими названиями плюроники®, синпероники или полоксамеры®, с 1960—1970-х годов используются в качестве эмульгаторов при производстве фармакологических препаратов и косметики [1]. Так, плюроник Б68, гидрофильные блоки (ПЭО) которого составляют 80 мас. %, входит в состав композиций искусственных заменителей крови, выполняя роль стабилизатора перфторуглеродных эмульсий [2]. Исследования в области экспериментальной медицины свидетельствуют о целесообразности использования 25—30% гелей плюроника Б127 для заживления ран. Внутривенное введение таких гелей при ожогах на ранней стадии ускоряет восстановление нормальной кожи у животных, стимулируя рост эпителиальной ткани [3].
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 0903-00445).
E-mail: grozdova@genebee.msu.ru (Гроздова Ирина Дмитриевна).
Возможность использования перечисленных соединений в медицине обусловлена их хорошей тканевой совместимостью, отсутствием иммуно-генности и низкой токсичностью по сравнению с ионными ПАВ [4]. Низкая токсичность неионных ПАВ была показана в экспериментах на животных [5].
Однако в последние годы в литературе стали появляться сообщения о побочных эффектах этих соединений. В экспериментах на животных было обнаружено, что плюроники Ь81, Р85 и Б68 и Кремофор ЕЬ ингибируют секрецию липопро-теинов в кишечнике [6]. Плюроник Б127 увеличивает содержание липидов в крови. Его поглощение эпителиальными и купферовскими клетками печени приводит к их вакуолизации и набуханию [7]. Такие ПАВ, как Полисорбат-80, Твин-80 и Кремофор ЕЬ вызывают анафилакто-идные реакции повышенной чувствительности [8]. Кремофор ЕЬ, используемый для эмульгирования водонерастворимых лекарств, отнюдь не является инертным носителем. Его применение сопровождается гиперлипидемией, агрегацией эритроцитов, патологическими изменениями в функционировании периферической нервной системы [9].
Очевидно, что описанные побочные эффекты обусловлены устойчивостью полимерных ПАВ к ферментативной деградации в организме. Эти
данные указывают на актуальность создания био-разлагаемых полимеров с минимальной токсичностью.
Поиск таких соединений проводится в нашей лаборатории на протяжении последних лет. При тестировании полимеров различной структуры на искусственных липидных мембранах мы обнаружили, что амфифильные незаряженные полимеры способны увеличивать проницаемость мембран для противоопухолевого антибиотика док-сорубицина, ускорять флип-флоп липидов [10] и образовывать поры, проницаемые для гидрофильных низкомолекулярных веществ [11]. Выраженность этих эффектов зависит главным образом от гидрофобности полимера и объема его гидрофобного блока, а при близких значениях указанных параметров — и от структуры гидрофильного блока: блок-сополимер, содержавший в качестве гидрофильного блока полиглицерин, был эффективнее по сравнению с плюрониками, включающими гидрофильные блоки ПЭО [10].
В связи с этим при создании биоразлагаемого полимера встает вопрос, какой должна быть его структура, чтобы обеспечить минимальную токсичность и требуемое эффективное воздействие на клетки.
В настоящей работе проведен сравнительный анализ токсичности амфифильных незаряженных полимеров различной структуры: линейных и разветвленных (табл. 1). Цитотоксичность всех соединений тестировали на человеческих раковых клетках, культивируемых in vitro. Для тех же веществ была определена кажущаяся ККМ в фос-фатно-солевом буферном растворе (0.01 моль/л Na2HPO4, 0.15 моль/л NaCl, рН 7.4) и способность образовывать поры в липосомах. Сопоставление цитотоксичности (токсичности для клеток в культуре) и физико-химических свойств исследованных полимеров позволило выявить критерии, по которым можно ориентировочно предсказать максимальную концентрацию полимера, безвредную для клеток.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали следующие коммерческие препараты: плюроники L61, F68 и Тритон X-100 ("Serva", Германия), плюроники F127, L64, P85, L81, P123, (BASF, США), F87 ("CarboMer", США), диблок-сополимер ЭО и ПО (Научно-исследовательский институт органических полупродуктов и красителей, Москва), предоставленный профессором И.Н. Топчиевой, чередующийся и блок-сополимеры диметилсилоксана (ДМС) и ЭО ("Polysciences", США), полиоксиэтиленлау-риловый эфир (Бридж-35, "Fluka", США). Блок-сополимеры ПО и глицерина (ГЛ) были синтезированы в группе профессора Х. Фрая (Институт органической химии, Университет Иоанна Гут-
тенберга, Майнц, Германия) [10]. Структурные формулы соединений приведены в табл. 1.
Также использовали 1,6-дифенил-1,3,5-гекса-триен (ДФГТ) ("Reanal", Венгрия), гидрохлорид доксорубицина (DOX) (ЛЭНС-ФАРМ, Россия), 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразо-лий бромид (краситель метилтетразолиевый синий - МТТ) ("Sigma-Aldrich", США).
Молекулярно-массовые характеристики плю-роника F127 определяли методом ГПХ в ТГФ при 35°С на жидкостном хроматографе "Waters" с рефрактометрическим детектором, колонками, заполненными ультрастирагелем с размером пор 103 и 105 Á, и линейной колонкой. Хроматограм-мы обрабатывали на интеграторе "Data Module-730". ММ полимера рассчитывали, используя калибровку по узкодисперсным стандартам ПЭГ с молекулярной массой от 600 до 23 000 фирмы "Waters".
ККМ полимеров оценивали по возрастанию интенсивности флуоресценции ДФГТ, наблюдающемуся при его солюбилизации в гидрофобном ядре мицелл [12]. Раствор 0.01 моль/л ДФГТ в ацетоне разбавляли в 100 раз фосфатно-солевым буферным раствором и интенсивно перемешивали на магнитной мешалке в течение 2-3 ч. Полученный 1 х 10-5 моль/л раствор ДФГТ смешивали с равным объемом полимера, растворенного в таком же буфере, и инкубировали в течение 3060 мин при 37°С. Флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре "Hitachi 650-10S" (Япония) в термостатированной кювете при 37°С (^возб = 366 нм, ^исп = 433 нм). ККМ находили по излому зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации полимера.
ККМ и гидродинамический радиус полимерных ассоциатов определяли также методом статического и динамического светорассеяния [13].
В работе использовали пять линий человеческих клеток, растущих в культуре: клетки эритро-лейкемии (K562) и аденокарциномы молочной железы (MCF7) и три их сублинии, устойчивые к действию лекарств. Одну из них (K562/i-S9) получили путем инфицирования клеток K562 ре-комбинантным вирусом, содержащим ген mdr1, а две других (K562/DOX, MCF7/DOX) - последовательной селекцией клеток К562 и MCF7 в присутствии соответственно винкристина или доксо-рубицина - противоопухолевых антибиотиков, применяемых в клинической практике.
Растущие в суспензии человеческие эритроми-елобластоидные клетки линии К562, их сублинии К562Д^9 и ^62/DOX культивировали в среде RPMI 1640, содержавшей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2 х 10-3 моль/л глютамина и 50 мкг/мл антибиотика гентамици-на, в СО2-инкубаторе "NAPCO" (США) (стан-
Таблица 1. Состав, структура и молекулярная масса исследованных полимеров
Полимер
Состав сополимера
I. Плюроники Ио4СИ2-СИ2-0^—(-СИ-СН2-0^(-СН2СН204-Н
и/2Х 1 т и/2
' СИ3 т '
Ь61
Ь64
Б68
Ь81
Р85
Б87
Р123
Б127
ЭО2ПО30ЭО2 ЭО,3ПО30 ЭО
'13
ЭО76ПО30ЭО76 ЭО3ПО40ЭО3
ЭО27ПО40ЭО
40-
^27
ЭО61ПО40ЭО61 ЭО20ПО70ЭО20
ЭО100ПО69ЭО
69-
100
1900 2900 8400 2750 4600 7700 5800 12600
СИ3 /
И0-(-СИ-СИ2-0^-(-СИ2СИ204-С-СИ
Ли 19 24 \ тт
REP
II. Диблок-сополимер ППО и ПЭО I ?-Ви-ЭО24ПО19
СИ3
СИ3
2190
Н3С
ы3с-о-(сысы9оЫсы9сы9о
30
V
(С)п/4 О
О-(С)пД
N
сн3
-О-
'(С)п/4
-О
Р02
Р030
Р076
ЭО54-ДМС7
III. Полиглицерины
ПО30ЭО6ГЛ2
ПО30ЭО6ГЛ
6 30
(ЭО-ДМС)7
ПО30ЭО6ГЛ76
IV. Сополимеры диметилсилоксана и этиленоксида блочный ^(СЫ3)2О)7-ЭО54
'СИЛ СИз
СИ3— (0- СИ2СИ2)54—0
81—ОЧ^-СИ
СИ3
/ I
з
СИ3
чередующийся (Si(CЫ3)20-Э0)7
(ИзС)з8Ю'
СИ
I
з
0-81-0"
СИз
-81(СИз)з
(0)п/4
2267 3600 7760
3000
750
Тритон Х-100
Бридж-35
V. Углеводородсодержащие ПАВ Трет-нонил-РЬ-(ЭО)10 СИ3
ИзС. ИзС
С12Ы25ЭО24
С12Ы25(СЫ2СЫ2 О)24Ы
/--^СИ2СИ2^И
сиСиз
650
1225
3
7
Доля выживших клеток, % 150 h
100
50
0 -
10
.-i
10°
101 102 103 [L61] х 106, моль/л
Рис. 1. Типичная зависимость доли выживших клеток от концентрации полимера на примере плюроника Ь61 и клеток К562.
де без сыворотки и инкубировали в течение 1 ч. В контрольные лунки (100% выживших клеток) не добав
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.