БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 5, с. 626 - 635
УДК 577.322
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ АМИЛОИДНЫХ ОЛИГОМЕРОВ ЛИЗОЦИМА: ЧАСТНЫЙ СЛУЧАЙ ИЛИ ОБЩЕЕ ПРАВИЛО ДЛЯ АМИЛОИДНЫХ СТРУКТУР?*
© 2006 г. М. Малишаускас1, А. Даринскас2, В.В. Замотин1, А. Гарибян1, И.А. Костанян3, Л.А. Морозова-Рош1,4**
1 Отдел медицинской биохимии и биофизики Университета Умеа, 90187 Умеа, Швеция; электронная почта: ludmilla.morozova-roche@medchem.umu.se 2 Институт иммунологии Вильнюсского университета, 08409 Вильнюс, ул. Молети, 29, Литва; электронная почта: innovita@innovitaresearch.org
3 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, электронная почта: iakost@mail.ibch.ru
4 Институт биологического приборостроения РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 7
Поступила в редакцию 17.10.05
Исследованы молекулярные механизмы цитотоксичности амилоидных структур лизоцима из молока лошади. Показано, что лизоцим образует растворимые амилоидные олигомеры и протофибриллы в ходе инкубации при 57° и при рН 2,0 и 4,5. Эти структуры связывают амилоидные красители тиофлавин Т и конго красный, морфология и размеры которых были проанализированы с помощью атомной силовой микроскопии. Установлено, что мономерный лизоцим и его фибриллярные структуры не влияли на выживаемость трех типов клеток, используемых в наших экспериментах (в частности, первичных нейронов, первичных фиб-робластов мыши и клеток линии нейробластомы 1МЯ-32). Однако растворимые амилоидные олигомеры лизоцима вызывали гибель всех клеточных культур, о чем свидетельствовало окрашивание клеток с помощью бромистого этидия. При этом первичные культуры клеток оказались более чувствительными к действию амилоида, чем клетки линии 1МЯ-32. Отмечено, что цитотоксичность амилоида зависела от размеров олигомерных частиц: растворы, содержавшие 20-меры, образованные при рН 4,5, были более токсичны, чем тетрамеры и октамеры, наблюдаемые в растворе при рН 2,0. Показано, что растворимые амилоидные олигомеры способны собираться в кольца, однако корреляции между числом колец в образце и его токсичностью не наблюдалось. Факт цитотоксичности промежуточных олигомеров такого распространенного белка, как лизоцим, подтверждает гипотезу, что цитотоксичность является общей чертой белкового амилоида. Предотвращение образования промежуточных олигомерных форм, таким образом, является ключевым моментом в предупреждении амилоидных патогенезов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: амилоид, атомно-силовоя микроскопия, цитотоксичность, апоптоз, олигомеры.
Определение молекулярных механизмов патологических процессов, связанных с образованием и накоплением амилоидных агрегатов в различных органах и тканях в ходе амилоидных заболеваний (болезни Альцгеймера и Паркин-сона, диабет второго типа, наследственные амилоидные полиневропатии и др.), остается главной задачей современных исследований [1—5]. Многочисленные наблюдения показали, что об-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-230, 26.02.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
разование амилоида вызывает тканевое повреждение и гибель клеток. В то же время очевидно, что при различных амилоидных заболеваниях количество амилоидных отложений может варьировать в очень широких пределах (от миллиграммов до килограммов). Последнее наблюдается, например, при скоплении лизоцимного амилоида в печени больных системным амилои-дозом [6, 7]. Однако в ходе нейродегенератив-ных заболеваний типа болезни Альцгеймера прямой взаимосвязи между количеством амилоида и степенью прогрессирования заболевания не наблюдается. Есть указания на то, что у пациентов с болезнью Альцгеймера даже на поздних
стадиях заболевания значительные скопления амилоида в головном мозгу тем не менее отсутствуют. В то же время уровень растворимых амилоидных олигомеров в мозгу таких пациентов оказывается сильно завышенным [8, 9].
Исследования цитотоксичности амилоидных структур активно ведутся на примере многих природных белков (как тех, что играют роль в развитии болезней, так и тех, которые образуют амилоид in vitro) [9—12]. Амилоидные образования обладают общими свойствами (например, формированием р-слойного фибриллярного ядра), что позволяет объединять их в одну группу [13]. Эти наблюдения привели к гипотезе об общих функциональных свойствах амилоидных фибрилл и, следовательно, об общих механизмах амилоидной цитотоксичности [11]. Имеются указания на то, что особенно цитотоксичны-ми как in vivo, так и in vitro являются предфиб-риллярные агрегаты [9—12]. Действительно, предфибриллярные образования, не связанные с клиническими амилоидозами белков, таких как а-лактальбумин [12], 8И3-домен или белок HypF-N [11], проявляют цитотоксичные свойства. В то же время зрелые фибриллы этих же белков, а также связанные с патологиями фибриллы Ар-пептида и транстиретина цитоток-сичностью не обладают [10, 11]. Однако в силу значительной гетерогенности амилоидных образований, наблюдаемых даже в пределах одного и того же образца белка, и пока не совсем четкого определения, что же является предфибрил-лярной структурой, до сих пор не выяснено, какой именно тип амилоидных структур токсичен и запускается ли клеточная гибель амилоидом с помощью специфического молекулярного механизма или он вызывает чисто механическое повреждение клеточных структур.
Цель настоящей работы — исследование ци-тотоксических свойств амилоидных структур лошадиного лизоцима, белка, присутствующего во многих органах и тканевых жидкостях, в частности в молоке кобыл. Лизоцим, концентрация которого в молоке кобылы составляет сотни миллиграммов, играет важную роль в защите организма от внешних бактериальных инфекций [14]. В то же время ферментированное молоко (кумыс) широко используется как напиток, обладающий целебными свойствами. Лошадиный лизоцим служит также модельным белком при исследовании структуры и общих принципов сворачивания белка [15—17]. Он принадлежит к большому семейству структурно-гомологичных белков, лизоцимов и а-лак-тальбуминов. Лошадиный лизоцим занимает особое положение среди этих белков, так как в нем отражены структурные характеристики и свой-
ства сворачивания обоих семейств (рис. 1) [15—18]. Лошадиный лизоцим обладает бакте-риолитической активностью традиционных ли-зоцимов. В то же время в отличие от яичного ли-зоцима он содержит кальцийсвязывающий центр, подобный а-лактальбуминовому центру. В силу этого было предложено рассматривать лошадиный лизоцим в качестве эволюционного моста между двумя семействами [15, 18].
Важно отметить, что белки лизоцим-а-лак-тальбуминового ряда оказались амилоидоген-ными. В 90-е годы ХХ в. было обнаружено, что системные амилоидозы человека вызываются амилоидными мутантными формами человеческого лизоцима [6, 7]. Было показано также, что человеческий лизоцим дикого типа может образовывать амилоидные фибриллы in vitro, которые не отличаются ни по морфологическим, ни
Рис. 1. Схема молекулы лошадиного лизоцима, построенная с помощью программного обеспечения ЯавМо!
по структурным свойствам от амилоидных образований, связанных с болезнью [19]. Хотя человеческий а-лактальбумин образует зрелые фибриллы [20, 21], именно у его олигомерных структур была обнаружена цитотоксичность по отношению к незрелым и раковым клеткам [12]. Недавно нами было показано, что в отличие от традиционных лизоцимов и а-лактальбуминов [19—21] лошадиный лизоцим образует короткие линейные протофиламенты, которые не достигают микронной длины зрелых фибрилл, а также замкнутые кольца. При этом число колец и их размеры зависят от концентрации ионов кальция и pH раствора [22]. Исследование цито-токсичных свойств кольцевых амилоидных структур особенно важно, так как в последние годы было предположено, что именно амилоидные кольца Aß-пептида и а-синуклеина играют ключевую роль в патогенезе болезней Альцгей-мера и Паркинсона, вызывая гибель нейрональ-ных клеток [23]. В данном исследовании в условиях фибриллобразования до начала формирования филаментных структур были получены растворимые амилоидные олигомеры лошадиного лизоцима и их токсическое действие на различные виды клеток сравнивалось с действием мономерного белка и зрелых фибрилл. При этом было показано, что токсичные свойства амилоидных олигомеров находятся в прямой зависимости от их размеров.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Образцы белка. Лошадиный лизоцим был выделен из лошадиного молока по методике, описанной ранее [24]. Концентрация белка определялась на спектрофотометре UV-VIS («Beckman», США) c использованием коэффициента поглощения при длине волны 280 нм E1% 23,5 [24]. Для получения амилоидных структур лизоцим инкубировался при концентрации 20 мг/мл (1,36 мМ) в 20 мМ глициновом буфере, pH 2,0, или в 10 мМ Na-ацетатном буфере, pH 4,5, в присутствии 0,2% азида натрия при 57°, как описано ранее [22].
Взаимодействие амилоидных образцов с тио-флавином Т и конго красным. Эксперименты по связыванию тиофлавина Т проводились по модифицированному методу Левине [25]. Спектры флуоресценции тиофлавина Т (450—550 нм) регистрировались на спектрофлуориметре Fluoro Max-2 («JOBIN YVON/PSEX Instruments», США) при длине волны возбуждения 440 нм и ширине щелей 5 нм при возбуждении и эмиссии соответственно. Перед началом каждого эксперимента готовился свежий базовый раствор тиофлавина Т с концентрацией 2,5 мМ в фосфатном буфере,
содержавшем 10 мМ фосфат калия и 150 мМ хлорид натрия, рН 7,0. Раствор пропускался через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Измерения интенсивности флуоресценции начинались через 4—5 мин после добавления красителя к белковым образцам для достижения теплового равновесия в кварцевой кювете с длиной оптического пути 0,2 см. Образцы постоянно перемешивались. Для увеличения отношения сигнала к шуму интенсивность флуоресценции усреднялась в течение 60 с.
Связывание конго красного определяли по методике, описанной ранее [19]. Спектры поглощения реакционной смеси белка с конго красным регистрировались на спектрофотометре фирмы «Beckman».
Ато
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.