ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 3, с. 245-255
УДК 577.3
ТВЕРДОФАЗНОЕ И ПОВЕРХНОСТНО-МЕМБРАННОЕ ЖИДКОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРОМИЦЕТОВ, ОСОБЕННОСТИ ИХ РАЗВИТИЯ И ОБРАЗОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ (ОБЗОР)
© 2014 г. А. А. Осмоловский*, Н. А. Баранова*, В. Г. Крейер*, А. В. Кураков*, Н. С. Егоров**
*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991
**Международный биотехнологический центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119991
e-mail: aosmol@mail.ru Поступила в редакцию 25.10.2013 г.
Рассмотрены особенности развития микромицетов и биосинтеза ими ферментов, а также условия, обеспечивающие увеличение секреции ферментов микроскопическими грибами при твердофазном (на природных субстратах и инертных носителях) и поверхностно-мембранном жидкостном способах культивирования. Обсуждаются перспективы и преимущества таких способов культивирования микромицетов в сравнении с глубинными условиями с целью получения внеклеточных ферментов.
DOI: 10.7868/S055510991403026X
Микроскопические грибы — широко используемые и перспективные объекты современной биотехнологии. Благодаря образованию разнообразных внеклеточных ферментов и мицелиально-му характеру роста они способны колонизировать широкий круг субстратов. При этом среди продуктов метаболизма микромицетов много соединений, имеющих большое значение для человека.
Мицелиальные грибы используют при промышленном получении ферментов, антибиотиков, ста-тинов, гиббереллинов, каротиноидов, алкалоидов и органических кислот. Ввиду апикального роста и осмотрофного типа питания микромицеты распространяются по поверхности, способны проникать внутрь твердых субстратов, секретируя разнообразные экзоферменты. Ранее эти особенности при разработке способов культивирования грибов-продуцентов учитывали не в полной мере. Ставший традиционным глубинный способ культивирования микроорганизмов в последнее время рассматривается как менее подходящий для получения многих биологически активных веществ из мицелиаль-ных грибов [1—4].
В настоящее время активно изучаются альтернативные глубинному культивированию (ГК) способы: твердофазное культивирование (ТФК, англ. solid-state fermentation) [5, 6] и поверхностно-мембранное жидкостное культивирование (ПМЖК, англ. membrane-surface liquid culture) [7]. ТФК и ПМЖК мицелиальных грибов имеют принципиальные отличия от глубинного культивирования. Во-первых, мицелий грибов представлен хорошо развитыми гифами, а не пеллетами, что имитирует естественные условия роста микромицетов.
Во-вторых, наблюдается высокая концентрация образуемых внеклеточных продуктов метаболизма и часто за более короткое время (в 2—14 раз превышающая глубинное). В-третьих, существуют различия в экспрессии генов, ответственных за синтез внеклеточных ферментов и других биологически активных веществ при ТФК и ГК [2—6].
ТВЕРДОФАЗНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
ТФК — процесс культивирования микроорганизмов на твердых, влагоемких и увлажненных частицах [1—8]. В такой системе вся жидкость (вода или питательная среда) полностью связана твердыми частицами, что определяет низкие, от 0.8 до 0.6, значения активности воды. Наиболее благоприятным способ ТФК является для мицелиальных форм микроорганизмов — мицелиальных грибов и, реже, стрептомицетов, эффективно колонизирующих твердые увлажненные субстраты и легко проникающих в них. Ввиду низкой активности воды при ТФК снижается возможность контаминации бактериями и дрожжами [8, 9]. Содержание воды при ТФК, как правило, составляет от 30—40% до 70—80%, в зависимости от используемых субстратов [10,11].
Характеристика ТФК и физиологические особенности роста мицелиальных грибов в условиях
ТФК. При ТФК микромицеты развиваются в условиях более выраженных градиентов концентраций питательных веществ, кислорода, температуры и продуктов метаболизма, а также градиентов воды, чего нет в глубинных условиях куль-
Газообмен O2 CO2
Воздушные гифы
Аэробный слой мицелиального мата
Анаэробный слой мицелиального мата
Пенетрантные гифы
Субстрат твердой фазы
Рис. 1. Схема развития мицелия микромицетов при твердофазном культивировании.
тивирования [4]. Подобные условия существенно влияют не только на физиологию микромицетов, но и на их биохимическую и ферментативную активность. В связи с этим, Х. Барриос-Гонзалез [4] предложил выделить физиологию микроорганизмов, развивающихся в условиях ТФК, в новую самостоятельную категорию как "физиологию твердой среды" (англ. physiology of solid medium), основными отличиями которой являются низкая активность воды, связь мицелия с твердым субстратом или носителем и наличие постоянного контакта мицелия с воздухом [4, 12]. Несмотря на то, что эти признаки характерны и для микроорганизмов, культивируемых поверхностным способом на агаризованных средах, мы считаем, что ТФК имеет одно существенное отличие, позволяющее обособленно рассматривать этот способ от поверхностного культивирования. Этим важным отличием является особенность физического состояния среды, представленной сыпучими средами (материалами), при культивировании на которых гифы не только врастают в субстрат, но и оплетают его отдельные частицы. Некоторые исследователи полагают, что связь мицелия и субстрата (адгезия) является ключевым параметром при ТФК [12]. Ввиду схожести адгезии для ТФК и пассивной иммобилизации, названной М. Гутир-рез-Корреа и Ж. Виленной "биопленочным культивированием" (англ. biofilm fermentation), был
предложен термин "поверхностное адгезивное культивирование" (англ. surface adhesion fermentation) [12]. Однако предложенный термин не отражает всех присущих ТФК физиологических отличий, в частности, физического состояния среды. При росте на увлажненной поверхности мицелиальные грибы синтезируют небольшие амфипатические белки — гидрофобины, снижающие поверхностное натяжение воды и участвующие в формировании воздушных гиф, для образования которых мицелий не обязательно должен быть связан с поверхностью, что наблюдается при поверхностном культивировании микромицетов в жидкой среде [13, 14].
В условиях ТФК, как и в природных условиях, после прорастания спор происходит удлинение гиф мицелия и колонизация поверхности субстрата с формированием мицелиального мата, который подвергается одновременному воздействию трех фаз — газовой, твердой и жидкой (представленной в капельной форме) [15]. Мицелий при этом морфологически дифференцирован на воздушные гифы, на которых формируются репродуктивные структуры, гифы мицелиального мата и субстратные (пенетрантные) гифы, пронизывающие и плотно переплетающие частицы субстрата (рис. 1). Благодаря наличию между частицами субстрата микропространств (пор), заполненных жидкостью (водой или питательной
средой), пенетрантный мицелий микромицетов может поглощать питательные вещества и выделять в окружающую среду ферменты и конечные продукты метаболизма. Воздушный мицелий, благодаря наличию пространств между гифами, заполненными воздухом, поглощает кислород и осуществляет газообмен между всеми частями мице-лиального мата [6, 16].
Мицелий основной части мата при активном росте микромицета дифференцирован физиологически: в условиях достаточной влажности пространства между гифами воздушного мицелия заполняются водой, что приводит к уплотнению мицелия и его преобразованиию в мицелий мата, в результате чего увеличивается толщина мицели-ального мата и его нижний слой становится анаэробным (рис. 1). Об этом свидетельствует и обнаружение этанола при культивировании Rhizopus oligosporus в условиях ТФК. Прямое измерение концентрации кислорода в мицелиальном мате с использованием кислородных микроэлектродов показало развитие градиента концентрации кислорода в его нижнем влажном слое после 36.5 ч культивирования микромицета [17].
Еще одной особенностью ТФК микромицетов является запасание гифами большого числа по-лиолов (глицерола, эритрола, арабитола). По-видимому, полиолы вовлечены в осморегуляцию и играют важную роль в предотвращении потери воды цитоплазмой клеток. Кроме того, эти соединения могут использоваться мицелиальными грибами в качестве источников углерода и энергии. Показано, что в их образование вовлечены НАД-зависимые дегидрогеназы, индукция которых вызывается в твердофазных условиях в ответ на возникающий в результате низкой активности воды осмотический стресс [18, 19].
Особый интерес представляют отличия в проявлении молекулярно-генетической активности микромицетов при ТФК. Так, исследования, проведенные с Aspergillus oryzae, показали различия в экспрессии 4628 генов при культивировании в глубинных и твердофазных условиях [4]. Функции около половины генов, которые экспресси-руются при ТФК, неизвестны.
Такие физиологические особенности роста микромицетов возможны при их культивировании только на увлажненных сыпучих средах.
Типы ТФК. Выделяют два типа ТФК: на естественных (разлагаемых) субстратах и с использованием инертных носителей [2—4]. В качестве естественных субстратов применяются отходы агропромышленных предприятий: отруби зерновых культур, жмых, багасса и т.д. В этом случае "твердая фаза" служит не только подложкой для развития микромицета, но и источником необходимых питательных веществ. Для увлажнения используется вода или раствор минеральных солей.
При культивировании на инертных носителях, таких как пенополиуретан, перлит, амберлит, си-ликагель — добавляют питательную среду.
Субстраты растительного происхождения широко используются в биотехнологических процессах при ТФК для получения грибных ферментов, поэтому, с целью повышения выхода желаемых ферментов постоянно проводится их подбор. Так, при использовании пшеничных отрубей наблюдается наибольший выход экзоферментов микромицетов, особенно гидролаз [10, 20]. Причем показана устойчивость образуемых ферментов к катаболитной репрессии при высокой концентрации глюкозы (10%) в системе [21, 22]. Многие натуральные субстраты доступны и дешевы, поскольку являются агропромышленными отходами. При их использовании одновременно решается проблема по их утилизац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.