ш
УДК 541.124:546.11.2
ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИЗОТОПНЫЙ ОБМЕН ВОДОРОДА НА ДЕЙТЕРИЙ И ТРИТИЙ В ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОМ ИНСУЛИНЕ ЧЕЛОВЕКА
© 2014 г. Ю. А. Золотарев1*- #, А. К. Дадаян1*, В. С. Козик1*, Е. В. Гасанов1*, И. В. Назимов2*, Р. Х. Зиганшин2*, Б. В. Васьковский2*, А. Н. Мурашов3*, А. Л. Ксенофонтов4*, О. Н. Харыбин5*, Е. Н. Николаев6*, Н. Ф. Мясоедов1*
1*Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Курчатова, 2 2*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 3*Филиал ФГБУНИнститута биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 4*Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова 5*Институт биомедицинской химии РАМН 6*Институт биохимической физики РАН Поступила в редакцию 10.04.2013 г. Принята к печати 22.04.2013 г.
Исследована реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена, происходящая в пептидах и белках под действием активированного на катализаторе спилловер-во-дорода. Реакция человеческого генно-инженерного инсулина с дейтерием и тритием при 120— 140° C привела к включению 2—6 изотопных атомов водорода на молекулу. Для определения распределения изотопной метки по аминокислотным остаткам меченного тритием инсулина провели окисление S-S-связей в инсулине надмуравьиной кислотой, выделили полипептидные цепи, после чего провели их кислотный гидролиз, аминокислотный анализ и жидкостный сцинтилляци-онный счет трития в аминокислотах. Показано, что изотопная метка включается во все аминокислотные остатки белка, при этом наибольшее включение наблюдается в пептидный фрагмент FVNQHLCGSHLVE (B1-13) B-цепи инсулина, а остатки His5 и His10 этого фрагмента содержат около 45% всей изотопной метки белка. Для анализа распределения изотопной метки в пептидных фрагментах меченого инсулина использовали также восстановление S-S-связей 2-меркаптоэтано-лом, ферментативный гидролиз глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedius и разделение полученных пептидов с помощью ВЭЖХ. С помощью масс-спектрометрии идентифицированы пептидные фрагменты, образующиеся за счет гидролиза по связи Glu-Xaa в B-цепи. Масс-спектроскопи-ческий анализ изотопомерного состава образцов меченного дейтерием инсулина показал, что все молекулы белка участвуют в реакции твердофазного изотопного обмена водорода в равной мере. Меченный тритием инсулина полностью сохраняет физиологическую активность.
Ключевые слова: инсулин, мечение тритием и дейтерием, твердофазные реакции изотопного обмена, масс спектроскопия.
DOI: 10.7868/S0132342314010151
ВВЕДЕНИЕ
Твердофазные реакции органических соединений (или реакции без растворителя) являются ценным синтетическим методом и активно исследуются. В ряде случаев твердофазные реакции обладают несомненными преимуществами по сравнению с теми же превращениями в органических растворителях. Так, например, реакции восстановления ке-
Сокращения: СВ — спилловер-водород; ВТКИО — высокотемпературный твердофазный каталитический изотопный обмен.
# Автор для связи (тел.: +7 (495) 196-02-13; факс: +7 (495) 196-02-21; эл. почта: zolya@img.ras.ru).
тонов под действием №БИ4 [1, 2] и гидрирования дигидроксибензолов [3] в твердой фазе обеспечивают больший выход и большую селективность. Твердофазное гидрирование алкенов и алкинов на Рё-катализаторах в отсутствие растворителя при 20°С происходит более гладко, чем в тетрагидрофу-ране [4]. Особенностью твердофазных каталитических реакций с участием водорода является то, что они могут происходить как на металлических центрах катализатора, так и на новых кислотных центрах, образующихся в твердой фазе под действием спилловер-водорода (СВ) [5]. Такая двойственная природа катализа приводит к значительным из-
I-1 А-цепь
Н—01у—Пе—Уа1—01и—01п—Су8—Су8—ТЬг—8ег—11е—Су8—8ег—Ьеи—Туг—01п—1.еи— О1и—А8п—Туг—Су8—Ап—Он
В-цепь
\ /
-Су8-01у—8ег—Н18—Ьеи—Уа1—01и—А1а—Ьеи-Туг—Ьеи—Уа1—Су8—(
Н—РЬе—Уа1—А5п—01п—Н15—Ьеи—Су8—01у—8ег—Н18—Ьеи—Уа1—01и—А1а—Ьеи—Туг—Ьеи—Уа1—Су8—01у—01и—Аг§—01у—РЬе—РЬе—Туг—ТЬг—Рго—Ьу8—ТЬг—ОН Рис. 1. Строение человеческого генно-инженерного инсулина.
менениям в механизме и селективности твердофазных реакций с участием СВ.
Несмотря на то, что процессы, протекающие с участием СВ, известны уже много лет, отсутствует общепринятое мнение о природе этой активной частицы. К моменту начала наших исследований в литературе отсутствовали публикации, связанные с описанием химического взаимодействия между органическим веществом и СВ. Нами была предложена реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), происходящая под действием СВ и позволившая получить органические соединения с практически полным замещением водорода на тритий при сохранении их физиологической активности [6]. Эта реакция основана на пространственном разнесении твердого органического вещества и гетерогенного катализатора, что позволило избежать гидрогено-лиза на поверхности платиновых катализаторов.
В результате теоретического и экспериментального анализа реакции ВТКИО в аминокислотах установлен новый одноцентровой синхронный механизм замещения водорода при связи С—Н [7]. В переходном состоянии реакции образуется пяти-координированный углеродный атом, при котором имеется трехцентровая химическая связь, образованная с участием приходящего и уходящего водородных атомов. Квантово-химический расчет, основанный на принятии одноцентрового синхронного механизма ВТКИО, хорошо согласуется с наблюдаемой для этой реакции стереоселективно-стью и региоселективностью изотопного обмена водорода и дает значения энергии активации, близкие с полученными экспериментально.
Кинетические изотопные эффекты реакции ВТКИО с дейтерием и тритием в изолированных аминокислотахбыли исследованы экспериментально и с помощью квантово-химических расчетов. Показано, что в реакции ВТКИО кинетические изотопные эффекты твердофазного изотопного обмена водорода во много раз меньше тех, которые наблюдаются при жидкофазных реакциях [8]. Реакция ВТКИО позволяет получить высоко меченные тритием пептиды, полностью сохраняющие физиологическую активность и содержащие изотопную метку во всех фрагментах. С использованием квантово-химических расчетов показано, что в структурные ограничения существующие на А-спиральных участках полипептидных цепей приводят к снижению, а участие электронодонор-ных атомов О и N в стабилизации переходных со-
стояний к повышению способности к обмену водорода в аминокислотных остатках [9]. Реакция ВТКИО происходит на Бренстедовских кислотных каталитических центрах, образовавшихся под действием СВ из адсорбированной в твердой фазе воды. Уменьшение доступной для воды поверхности аминокислот в белках приводит к снижению их реакционной способности при ВТКИО. Взаимодействия в области контакта между полипептидными цепями в белках и белковых комплексах приводят к значительному уменьшению как доступной для воды поверхности, так и величины включения трития в аминокислоты, что позволяет использовать реакцию ВТКИО не только для получения меченых белков, но и для анализа ком-плексообразования в белках [10, 11]. Исследования химического взаимодействия между СВ и органическими соединениями обобщены в обзоре [12]. В предложенной статье исследуется региосе-лективность твердофазного изотопного обмена водорода в инсулине и изотопомерный анализ меченного дейтерием белка.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Генно-инженерный инсулин (рис. 1) вводили в реакцию ВТКИО с водород-тритиевой смесью (1 : 1) при температуре 120°С. Полученный меченный тритием инсулин десорбировали Трис-буфером. Выделение и очистку [3Н]инсулина проводили обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 2). Реакция ВТКИО с инсулином происходит без значительной деструкции белка. Получен [3Н]инсулин с молярной радиоактивностью 40 Ки/ммоль (всего 3 мКи). С помощью радиохимического анализа было показано, что радиохимическая чистота выделенного продукта составляет 99%.
Был проведен анализ региоселективности включения трития в молекулу инсулина. Для анализа приготовили смесь, состоящую из 200 мкКи меченого инсулина и 1 мг изотопно незамещенного инсулина. Для разделения А- и В-цепей провели окисление в инсулине 8-8-связей надмуравьи-ной кислотой и выделили меченные тритием полипептидные цепи с помощью обращенно-фазо-вой ВЭЖХ. Радиоактивность полипептидов А- и В-цепей составила 39 и 151 мкКи соответственно.
Выделенные меченные тритием А- и В-цепи инсулина были подвергнуты кислотному гидролизу при 160°С с последующим аминокислотным анализом и определением молярной радиоактив-
мин
Рис. 2. Хроматографическая очистка [3И]инсулина (Пик № 1), полученного реакцией ВТКИО. Колонка Kromasil С18 7 мкм, 8 х 150 мм. Элюент: градиент ацетонитрила 20—70% в 0.1% ТЕА, 3 мл/мин. УФ-детекция 220 (СИ 1) и 254 нм (СИ 2).
ности полученных в результате гидролиза меченных тритием аминокислот. Разделение аминокислот в пептидных гидролизатах осуществляли на ионообменной колонке со смолой 2622SC-PH-HR с использованием ступенчатого градиента натрий-цитратных буферных растворов. Данные по включению трития в A- и B-цепи инсулина приведены в табл. 1 и 2.
Из приведенных данных следует, что изотопная метка включается во все аминокислоты белка, при этом наибольшее включение происходит в остатки His и Arg B-цепи инсулина. Наибольшая реакционная способность для реакции ВТКИО в инсулине отмечена для 2 остатков His, их общая молярная радиоактивность более чем на порядок выше, чем у большинства других аминокислот, а доля изотопной метки, включенной в эту аминокислоту превышает 45%. В B-цепи инсулина содержатся His5 и His10, с общим замещением водорода в этих положениях составляющим около 1.1 атома. К сожалению, результаты кислотного гидролиза B-цепи не позволяют определить их индивидуальную молярную радиоактивность.
Можно отметить, что сходная высокая реакционная способность остатков His наблюдалась при анализе региоселективности ВТКИО в коноток-сине [3H]CtxG1 [9]. Конотоксин CtxG1 состоит из 13 а.о., включает 2 S—S-связи, что обеспечивает жесткость глобулярной структуры. С помощью спектроскопии тритиевого ЯМР было пок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.