БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.993-999
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
ДВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СИСТЕМЫ ПОДВИЖНОСТИ ОБОНЯТЕЛЬНЫХ ЖГУТИКОВ ЛЯГУШКИ
© 2008 В.О. Самойлов* **, Е.В. Бигдай* **, Я.Н. Руденко**, В.В. Бекусова***, Б.А. Дудич*
*Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 195251, Санкт-Петербург,
ул. Политехническая, 29; **Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; ***Военно-медицинская академия, 194044, Санкт-Петербург, ул. Комиссара Смирнова, 10
E-mail: се11@т/гап.ги Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Методом прижизненной телевизионной микроскопии изучена двигательная активность жгутиков обонятельных клеток лягушки Rana 1етрогапа под действием одорантов: амилового спирта, камфоры, цинеола, ванилина (первая группа), аммиака и сероводорода (вторая группа) и ингибиторов клеточного дыхания (ротенона и малоната). Показано, что обонятельные жгутики имеют как динеин-тубулиновую, так и актин-миозиновую молекулярные системы подвижности: первая обеспечивает неупорядоченные, а вторая - упорядоченные движения. Упорядочение подвижности происходит под действием одорантов. Влияние одорантов, принадлежащих к разным двум группам, на активность дыхательной цепи митохондрий и подвижность обонятельных жгутиков различно.
Ключевые слова: обонятельные жгутики, реорганизация цитоскелета, митохондриальное дыхание, динеин-тубулиновая и актин-миозиновая системы подвижности.
Обонятельные клетки являются первично-чувствующими (нейросенсорными) рецепторами. В них выделяют четыре основных морфо-функциональных отдела - верхушку, апикальный отросток, тело клетки и центральный отросток. Апикальный отросток на верхушке образует утолщение - булаву, снабженную жгутиками [1].
Различают три разновидности жгутиков, покрывающих поверхность обонятельных клеток: короткие и тонкие (20 - 30 мкм в длину), такой же длины, но более толстые, содержащие от двух до восьми жгутиков, заключенных в общую плазмалемму, и длинные (50 - 200 мкм). В состав их аксонем входит набор из 9x2+2 микротрубочек. Каждая пара из девяти периферических дублетов состоит из полной и неполной микротрубочек, взаимодействующих друг с другом посредством молекул динеина, которые работают как «цитомышцы» на тубу-линовом «цитоскелете». Такой набор ультраструктур характерен для всех локомоторных ресничек и жгутиков и обеспечивает их движения [1,2].
Сокращение: НАДН - восстановленный никотинамидаде-ниндинуклеотид.
Вопреки утверждениям некоторых исследователей [3], показано, что обонятельные жгутики всех позвоночных подвижны [1]. В отсутствие одорантов они совершают неупорядоченные изгибательные, волнообразные и воронкообразные движения. Короткие тонкие и толстые обонятельные жгутики колеблются с разной частотой: от 20 до 40 - 50 колебаний в минуту - первые и от 15 до 30 движений - вторые, а длинные двигаются с частотой 10 - 25 в минуту
[4].
Однако результаты электронно-микроскопических исследований показали, что в обонятельных жгутиках лягушек и крыс аксонема, образованная 9x2+2 микротрубочками, сосредоточена только в проксимальном отделе, а в дистальном участке обонятельного жгутика их состав неполный, причем ближе к его верхушке число микротрубочек постепенно уменьшается до одной - двух [1-3]. Таким образом, дисталь-ная часть жгутика оказывается лишенной ту-булярного цитоскелета, а следовательно, и молекулярных механизмов подвижности. Поэтому в активном локомоторном акте может участвовать, вероятно, только проксимальный отдел, тогда как дистальная часть пассивно следует за ним, и поэтому в процессе движения обонятельного жгутика она может закручиваться
в виде петли или диска, которые описаны при изучении фиксированных гистологических препаратов [1].
Значение подвижности жгутикового аппарата до сих пор неясно. Полагали, что основное ее предназначение сводится к перемешиванию обонятельной слизи с растворенными в ней молекулами пахучих веществ, что обеспечивает более быстрый их контакт с мембранными рецепторами. Однако это маловероятно, поскольку перемешивание слизевого секрета в носовой полости наземных позвоночных обеспечивается мерцательным эпителием [1].
По мнению А.А. Бронштейна [1] и по нашим данным [5,6], цилиарный аппарат обонятельных клеток является специализированной антенной, обеспечивающей активный поиск и обнаружение одорантов в слизи. Неупорядоченные движения обонятельных жгутиков в отсутствие одорантов осуществляются в режиме «рыскания» в довольно обширном пространстве. Возможно, такой характер их двигательной активности обеспечивает рецепторной клетке «ёкес-tional sensing» (направленное чувствование), что повышает вероятность встречи молекул одо-рантов с мембранными рецепторами, сосредоточенными в дистальном отделе обонятельных жгутиков.
При изменениях ионного состава среды или под действием лимонена, пиридина, амилацетата жгутики изменяют свою двигательную активность [5-7]. Движения ресничек мерцательного эпителия животных, а также жгутиков одноклеточных организмов нуждаются в энергетическом обеспечении [8-10]. Однако проблема снабжения энергией локомоторной активности обонятельных жгутиков, а также инициируемой одорантами реорганизации цитоске-лета в них до сих пор не только не решалась, но и не ставилась исследователями обонятельной рецепции.
Целью нашей работы было изучение участия двух молекулярных систем подвижности в локомоторной активности обонятельных жгутиков в отсутствие одорантов и при их наличии, а также ее энергетическое обеспечение.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования двигательной активности обонятельных жгутиков в реальном времени мы применяли метод прижизненной телевизионной микроскопии. Для этого тонкий срез препарата обонятельной выстилки в капле раствора Рингера (рН 7,33) размещали на предметном столике светового микроскопа МИКМЕД-2 (ЛОМО, C.-Петербург, Россия). Общее увеличение системы для прижизненной люминесцентной микроскопии составляло 104.
Это позволяло увидеть отдельные обонятельные жгутики на тонких срезах обонятельной выстилки и наблюдать их движение.
Растворы одорантов (цинеол (Molecular Probes, Portland, OR), амиловый спирт, камфора и аммиак (все Реахим, С.-Петербург, Россия) -10 мкМ; ванилин (Мо1еси1аг Probes, Portland, OR) - 100 мкМ; Р-меркаптоэтанол (Sigma Che-mkals, St Louis, MO) 1:10000) подавали в проток под покровное стекло и регистрировали двигательную активность обонятельных жгутиков в ответ на раздражитель с помощью цифровой видеокамеры, аппаратного декодера и персонального компьютера. Более подробно данная методика описана нами ранее [5].
Для объективного анализа двигательной активности была разработана уникальная программа, в основу которой положено предположение о том, что обонятельный жгутик осуществляет поиск по алгоритму суперпозиции изображения. Такой алгоритм применяется в вычислительной технике для нахождения различий между двумя изображениями [11]. Использование разработанного прикладного пакета позволило построить трехмерные диаграммы движений обонятельных жгутиков в реальном времени (рис. 1).
Для исследования энергетического обеспечения локомоции применяли фармакологический анализ. В качестве ингибиторов клеточного дыхания в обонятельных клетках использовали ротенон, 5 мкМ (Moleralar Probes, Portland, OR) - специфический ингибитор НАДН-дегидрогеназного участка дыхательной цепи и малонат, 50 мМ (Sigma Chemkals, St Louis, MO), который подавляет активность сукцинат-убихиноноксидоредуктазы или II комплекса дыхательной цепи митохондрий. Изучали изменения характера двигательной активности обонятельных жгутиков под действием этих ингибиторов, а также их реакции на стимуляцию одо-рантами на фоне ингибиторов.
Полимеризованный F-актин исследовали посредством конфокальной сканирующей им-мунофлуоресцентной микроскопии. Для этого обонятельную выстилку резали на тонкие пласты, помещали на силиконизированные покровные стекла, покрытые фибронектином, и культивировали в течение 1 ч. Затем препарат в течение 10 мин фиксировали 3% формалином на растворе Pингеpа и 15 мин пермеабилизовали 0,1% раствором тритона X-100 в растворе Pин-гера. Обонятельную выстилку промывали три раза раствором Pингеpа и инкубировали с мо-ноклональными антителами к рб5 и вторыми антителами, конъюгированными с тетрарода-минизоцианатом (TRITC), полученными против иммуноглобулинов мыши. Все инкубации с антителами проводили 30 мин и после каждой
Рис. 1. Трехмерные диаграммы, отображающие движения обонятельного жгутика до (а) и после (б) воздействия цинеола (10 мкМ).
инкубации клетки трижды промывали раствором Рингера. Иммунофлуоресцентный сигнал выявляли с помощью родамин-фаллоидина, являющегося флуоресцентной меткой F-актина. Полимеризованный F-актин разрушали с помощью цитохалазина. Для этого через 1 ч после культивирования обонятельной выстилки на си-ликонизированных покровных стеклах меняли среду на другую, содержащую 100 нг-мл-1 эпи-дермального фактора роста и 2 мкг-мл-2 цитохалазина (все Мо1еси1аг Probes, Portland, OR), и повторяли описанную выше процедуру. Препараты исследовали с помощью конфокального микроскопа Ье1са (Ье1са MiCTosystems, Bensheim, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали HeNe-лазер (543 нм). Флуоресцен-
цию регистрировали в диапазоне длин волн 580 - 640 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты наших исследований показали, что обонятельные жгутики лягушки без стимуляции их одорантами совершают медленные неупорядоченные движения, которым свойственны сложные траектории (воронкообразные, изгибательные или волнообразные). Они движутся в режиме рыскания и не имеют определенной направленности (рис. 1а). При этом дистальные участки жгутиков сворачиваются в виде петли или диска. Поскольку дистальный конец жгутика лишен тубулярного цито скелета, а следовательно, молекулярных механизмов
Рис. 2. Иммунофлуоресценция полимеризованного Б-актина в обонятельной выстилке лягушки, стимулированной амиловым спиртом (а), и влияние цитохалазина на этот процесс (б). Цифровая микрофотография, объектив 63,0x1,32.
подвижности [1-3], основная роль в обеспечении неупо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.