БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 2, с. 111-116
УДК 577.352.2
УАБАИН-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ И УАБАИН-РЕЗИСТЕНТНАЯ ИЗОФОРМЫ Na+,K-ATP-a3bi ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТОК МОЗЖЕЧКА РЕГУЛИРУЮТ АКТИВНОСТЬ МАР-КИНАЗЫ
© 2008 г. Л. В. Карпова, Е. Е. Аккуратов, Е. Р. Булыгина, А. А. Болдырев
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва, Россия; тел. (495)939-13-98; электронная почта: aaboldyrev@mail.ru
Поступила в редакцию 26.07.2007 г.
Инкубация гранулярных клеток мозжечка с уабаином в концентрации 0.1 мкМ в течение 180 мин приводит к росту внутриклеточного уровня ионизированного кальция и активных форм кислорода (АФК), что, в свою очередь, вызывает активацию МАР-киназы (МАРК). Инкубация с уабаином в более высокой концентрации приводит к дальнейшей активации МАР-киназы. Антагонисты NMDA-рецепторов МК-801 и D-AP5 ослабляют эффект уабаина. Сделан вывод, что как уабаин-чув-ствительные, так и уабаин-резистентная изоформы №+,К+-АТР-азы вместе с NMDA-рецепторами вовлечены во внутриклеточные сигнальные пути, управляющие процессами пролиферации нейронов.
Na+,K+-ATP-a3a, трансмембранный фермент, обеспечивающий асимметричное распределение ионов натрия и калия на клеточной мембране, играет важную роль в регуляции клеточного гомеоста-за [1]. В последнее время внимание привлекает непосредственное участие этого фермента во внутриклеточных сигнальных каскадах. Предположения о регуляции клеточных функций №+,К+-АТР-азой вытекали из обнаруженного Аскари с соавт. [2] возрастания уровня активных форм кислорода (АФК) в кардиомиоцитах, инкубированных в присутствии специфического ингибитора этого фермента, уабаина. Оказалось, что связывание уабаина с №+,К+-АТР-азой активирует в этих клетках Scr-киназу, трансактивирующую EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), белок Ras и p42/44 МАРК (Mitogen-Activated Protein Kinase) [2, 3]. Более того, активация этих белков в кардиомиоцитах приводит к экспрессии протоонкогенов раннего ответа [4, 5]. Обнаруженная недавно способность уабаина вызывать сигнал АФК в нейрональных клетках [6, 7] позволяет предполагать, что №+,К+-АТР-аза вовлечена в процессы внутриклеточной сигнализации и в других клетках.
Известно, что в возбудимых тканях Na+,K+-АТР-аза экспрессируется в виде нескольких изо-форм, имеющих разную чувствительность к сердечным гликозидам (а1-изоформа относительно устойчива к ним, она взаимодействует с уабаином в области концентраций 10-6-10-3 М; а2- и а3-изо-формы, напротив, очень чувствительны к уабаину и ингибируются им уже при концентрациях 10-910-6 М [8]. Хотя в онтогенезе головного мозга а2-и а3-изоформы фермента появляются позже, чем а1, в нейронах мозжечка 10-12-дневных крыс уже
присутствуют все три изоформы Ка+,К+-АТР-азы [9, 10].
В этих же структурах широко представлена глутаматергическая система, и именно в нейрональных клетках она устроена наиболее сложным образом [11]. Из более чем 12 известных глутамат-ных рецепторов, обеспечивающих передачу возбуждения и его модуляцию, глутаматные рецепторы КМБА-класса (активируемые К-метил-Б-аспар-татом, КМБА) играют особую роль в процессах распознавания объектов, обучения и т.д. Активация КМБА-рецепторов вызывает в нейрональных клетках Са-сигнал и увеличение уровня АФК, которые также могут выполнять сигнальную функцию [12]. Одной из мишеней АФК в нейроне служит Ка+,К+-АТР-аза, которая сама, в свою очередь, регулирует их образование [7]. Таким образом, взаимодействие Ка+,К+-АТР-азы и КМБА-рецепто-ров может иметь существенное значение для процессов внутриклеточной сигнализации.
В нашем сообщении с использованием проточной цитометрии и моноклональных антител к МАР-киназе показана активация фосфо-р44/42 МАРК при инкубации гранулярных клеток мозжечка с уабаином как в низкой, так и в высокой концентрации. Кроме того, мы обнаружили, что ингибиторы КМБА-рецепторов МК-801 и Б-АР5 препятствуют активации МАР-киназы уабаином.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Гранулярные клетки мозжечка получали из головного мозга 9-12-дневных крыс. Животных де-капитировали, извлекали мозжечок и измельчали его на холоду, срезы мозжечка помещали в раствор коллагеназы, приготовленный на растворе
112
Количество клеток
256 г
64 г
КАРПОВА и др
64
0
256
102 FL-1
0
103 104 100
Фосфо-МАРК, отн. ед. 3г
101
102 FL-1
103
104
а
д
2
180 мин
30 мин
1
0
Рис. 1. Активация фосфо-р42/44 МАР-киназы (а, б) и общей р42/44 МАР-киназы (в, г) при инкубации нейронов в отсутствие (контроль; серая гистограмма) и в присутствии 0.5 мМ NMDA (черный контур) в течение 30 (а, в) и 180 мин (б, г) соответственно. Из данных цитограмм определено значение медианы флуоресценции, т.е. среднее значение флуоресценции ФИТЦ-меченых антител (FL-1), связавшихся либо с фосфо-р42/44 МАР-киназой, либо с р42/44 МАР-киназой. Их соотношение представлено на графике д (в контроле данное соотношение принято за 1). Белые столбики - интакт-ные клетки (без воздействия лиганда), серые столбики - клетки, инкубированные с 0.5 мМ NMDA. По оси ординат показано увеличение соотношения фосфорилированной фракции и общей фракции МАР-киназы за время инкубации с лигандом.
Тироде (Wako collagenase, 2 мг/мл, 400 ед. акт; состав раствора Тироде: 148 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7.4). После 30 мин инкубации с коллаге-назой при 32°С кусочки ткани отмывали раствором Тироде и фильтровали через тефлоновый фильтр с порами размером 53 мкм. Содержание
клеток в суспензии определяли с помощью камеры Горяева. Перед инкубацией с различными веществами клетки оставляли на 30 мин при 37°С.
После инкубации с лигандами (время инкубации и концентрации лигандов указаны в подписях к рисункам) клетки подвергали пермеабилизации, а затем обрабатывали антителами против р42/44
Фосфо-МАРК, отн. ед. 3 г
0
Количество клеток 256
Контроль NMDA МК-801 D-AP5 NAC BAPTA
500 мкМ NMDA
Рис. 2. Предотвращение активации фосфо-р42/44 МАР-киназы в условиях инкубации нейронов в течение 180 мин с 0.5 мМ NMDA после их преинкубации в течение 10 мин с МК-801 (10 мкМ), D-AP5 (10 мкМ), N-ацетилцистеином (NAC, 1 мМ) или кальциевым хе-латором ВАРТА (50 мкМ). Соотношение медианы флуоресценции фосфорилированной фракции и общей фракции МАР-киназы в контроле принято за 1. По ординате показано увеличение соотношения фосфорилированной фракции к общей фракции МАР-ки-назы за 180 мин инкубации с 0.5 мМ NMDA и уменьшение его после преинкубации нейронов с МК-801, D-AP5, NAC или ВАРТА с последующей инкубацией с 0.5 мМ NMDA в течение 180 мин.
МАРК (Thr202/Tyr204) и фосфо-р44/42 МАРК (Thr202/Tyr204), сочетая таким образом фиксацию поверхностных клеточных рецепторов антигенов, пермеабилизацию клеток и последующее внутриклеточное окрашивание связавшихся с монокло-нальными антителами антигенов с непрямой реакцией иммунофлуоресценции. Флуоресценцию меченных ФИТЦ вторичных антител, связавшихся с внутриклеточными антигенами, оценивали методом проточной цитометрии.
Использовали NMDA, уабаин, N-ацетилцисте-ин (NAC) и ацетоксиметиловый эфир 1,2-бис(2-ами-нофенокси)этен-^^№,№-тетрауксусной кислоты (ВАРТА) фирмы "Sigma" (США); (5S,10R)-(+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-дибензо [a, d] циклопентен-5,10-иминмалеат (МК-801) фирмы "RBI" (США); 0-(-)2-амино-5-фосфонопентаноевую кислоту (D-AP5) фирмы "Tocris" (Великобритания).
Все измерения проводили не менее 3 раз, в повторных экспериментах использовали животных из разных семей. Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы "Биостатистика".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 приведены данные, иллюстрирующие активацию МАР-киназы после инкубации гранулярных клеток мозжечка с 0.5 мМ NMDA. Активация МАР-киназы обусловлена фосфорилировани-
256
102 103 104 ЕЬ-1
Рис. 3. Распределение нейронов мозжечка крысы вдоль оси флуоресценции, соответствующей фосфорилированной фракции р42/44 МАР-киназы, через 30 (а) и 180 мин (б) инкубации. Контроль - 1; клетки, инкубированные с 0.1 мкМ уабаина, - 2; клетки, инкубированные с 1 мМ уабаина, - 3. По оси ординат - количество клеток, по оси абсцисс - флуоресценция ФИТЦ-меченых вторичных антител, связавшихся с антителами к фосфо-р42/44 МАР-киназе.
ем треониновых и тирозиновых остатков, находящихся в активационной петле субдомена VIII [13]. Следовательно, увеличение интенсивности флуоресценции фосфо-формы МАР-киназы прямо указывает на увеличение доли фосфорилированной фракции белка р42/44 МАР-киназы, т.е. на ее активацию. Специфичность действия КМБА иллюстрируется тем, что его эффект подавляется в присутствии антагонистов кМЬА-рецепторов. Мы использовали МК-801, препятствующий открыванию КМБА-активируемых ионных каналов, и Б-АР5, ингибирующий связывание КМБА с рецепторами. Из рис. 2 видно, что оба лиганда в концентрациях, подавляющих действие КМБА, ослабляют активацию фосфо-р42/44 МАРК. Зависимость активности МАР-киназы от активности нейрональных
2
1
114
КАРПОВА и др.
Фосфо-р42/44 MAP-киназа, отн. ед. 2.2 г
Na+, К+-АТР-аза, % 1.0
-7 -6 -5 Уабаин, -lg C
Рис. 4. Сравнение влияния уабаина на фосфо-р42/44 МАР-киназу (а) и №+,К+-АТР-азу (•). Исходные значения параметров приняты за 1.
Фосфо-р42/44 MAP-киназа, % 250
200 150 100 50
0
Контроль 0.1 мкМ 0.1 мкМ 1 мМ 1 мМ
фосфо- уабаин уабаин уабаин уабаин
р42/44 +1 мМ +1 мМ
MAP- EGTA EGTA
1 мМ EGTA
Рис. 5. Влияние на активацию фосфо-р42/44 МАР-ки-назы кальциевого хелатора БОТА, способного связывать внеклеточный кальций. По оси ординат - флуоресценция ФИТЦ-меченых вторичных антител, связавшихся с антителами к фосфо-р42/44 МАР-киназе. Величины флуоресценции нормированы к контролю, принятому за 100%.
NMDA-рецепторов установлена ранее [14] и использована нами для выяснения причин активации этого фермента.
Предварительная инкубация клеток с N-аце-тилцистеином (NAC, природный антиоксидант, способный проникать внутрь клеток) или ВАРТА (внутриклеточный Са2+-буфер, связывающий ионизированный кальций в цитоплазме) также приводит к ослаблению активации фосфо-р42/44 МАРК в присутствии NMDA. По-видимому, предварительным этапом активации фосфо-р42/44
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.