научная статья по теме УАБАИН-ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ КИНАЗЫ ERK1/2 И ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА STAT3 В КЛЕТКАХ КАРЦИНОМЫ А431 Биология

Текст научной статьи на тему «УАБАИН-ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ КИНАЗЫ ERK1/2 И ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА STAT3 В КЛЕТКАХ КАРЦИНОМЫ А431»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 3, с. 226-234

УДК 577.152: 612.112.94

УАБАИН-ЗАВИСИМАЯ АКТИВАЦИЯ КИНАЗЫ ERK1/2 И ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА STAT3 В КЛЕТКАХ

КАРЦИНОМЫ А431

© 2007 г. И. В. Епифанцева, Т. А. Виноградова, И. И. Марахова

Институт цитологии РАН, 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4, факс: (812)297-03-41; электронная почта: iim@mail.cytspb.rssi.ru Поступила в редакцию 07.06.2006 г.

Исследовано влияние уабаина в широком диапазоне концентраций (10-7-10-3 М) на вход рубидия (аналог калия), внутриклеточное содержание калия и натрия, уровень фосфорилирования транскрипционных факторов семейства STAT и протеинкиназы ERK1/2, а также на фосфорилирование рецептора эпидер-мального фактора роста (ЭФР) в линии клеток А431 эпидермоидной карциномы человека. Показано, что уабаин в концентрациях 10-5-10-7 М увеличивает уровень фосфорилирования киназы ERK1/2, транскрипционного фактора STAT3 (но не STAT1) и рецептора ЭФР. Активирующие эффекты уабаина наблюдаются только в диапазоне малых концентраций и проявляются в условиях, при которых транспортная активность №+/К+-насоса и содержание ионов Na+ и К+ в клетках не изменяются. Повышение уровня фосфорилирования как рецептора ЭФР, так и белков ERK1/2 и STAT3, вызванное уабаином, блокируется CGP77675, ингибитором киназ Src-семейства. Сделан вывод, что рецептор ЭФР и киназы семейства Src принимают участие в индуцированной уабаином активации МАРК- и STAT-путей внутриклеточной сигнализации в клетках карциномы человека A431.

Зависимая от концентрации катионов натрия и калия АТР-аза (№+, К+-АТР-аза) - интегральный белок плазматической мембраны, экспрессируе-мый практически во всех клетках эукариот. Являясь главным регулятором концентраций калия и натрия в клетке, К+-АТР-аза участвует в поддержании трансмембранных градиентов этих катионов и играет важную роль в создании мембранного потенциала, регуляции клеточного объема, внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и Н+, транспорте необходимых метаболитов [1-5].

В последнее время появились исследования, которые дают основание считать, что помимо транспортной К+-АТР-аза может выполнять и сигнальную функцию [6-8]. Уабаин, стероидный гормон, связывается с каталитической а-субъединицей К+-АТР-азы и специфически ингибирует №+/К+-насос. Уабаин относится к семейству сердечных гликозидов, которые токсичны в высоких концентрациях, но в низких дозах оказывают положительное инотропное действие и применяются при хронической сердечной недостаточности [9]. Обширный клинический и экспериментальный материал свидетельствует также о том, что плазма крови человека и других млекопитающих содержит дигиталис-подобные вещества, которые служат лигандами к специфическому центру связывания на а-субъединице К+-АТР-азы и способны ингибировать этот фермент [10-13].

Недавно на кардиомиоцитах крысы было показано, что в присутствии малых доз уабаина активируется Ras/Raf/MEK/MAP-киназный сигнальный

каскад [14-16]. Обнаружено также, что в присутствии малых доз уабаина активируются киназы семейства Src и происходит трансактивация рецептора эпидермального фактора роста (ЭФР) [15-17]. Другие исследования показывают, что в кардиомиоцитах крысы индуцированное уабаином увеличение внутриклеточного Са2+ ведет к изменению активности протеинкиназы С и активации MAP-киназного каскада [7, 18, 19]. В результате этого начинается синтез транскрипционных факторов с-fos и c-jun, что, в конечном счете, вызывает непро-лиферативный рост (например, гипертрофию кар-диомиоцитов) [15, 20]. Таким образом, в присутствии уабаина в кардиомиоцитах активируются различные сигнальные пути. В последние годы опубликованы данные, которые свидетельствуют об индукции уабаином сигнальных событий не только в кардиомиоцитах, но и в других типах клеток [17, 21-25]. Вместе с тем вопрос о том, в какой мере универсальны события, обнаруженные на кардиомиоцитах, и могут ли они инициироваться при действии малых доз гликозидов в клетках других тканей, остается мало изученным. До настоящего времени состояние других сигнальных белков, индуцируемых в клетках после активации рецептора ЭФР (в частности, транскрипционных факторов семейства STAT), в тех условиях, в которых гликози-ды запускают MAP-киназный сигнальный путь, не изучалось. Цель настоящей работы - исследовать влияние уабаина в широком диапазоне концентраций на уровень фосфорилирования сигнальных белков STAT и ERK1/2, а также на фосфорилиро-

вание рецептора ЭФР в линии клеток А431 эпи-дермоидной карциномы человека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культивирование клеток. Для изучения уаба-ин-зависимой активации STAT-белков и МАР-ки-назного каскада использовали линию клеток А431 эпидермоидной карциномы человека, полученную из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Эта линия имеет эпителиальное происхождение и является монослойной культурой. Клетки культивировали во флаконах Карреля в течение 3-4 сут. Для культивирования использовали среду Игла в модификации Дальбек-ко (ДМЕМ) с добавлением L-глутамина ("Биолот", Санкт-Петербург), содержащую 10% телячьей эмбриональной сыворотки ("Биолот", Санкт-Петербург) и 40 мкг/мл гентамицина. Культуры растили до плотности не более 70% от плотного монослоя, снимали с субстрата раствором Версена с трипсином и для опыта высевали на пластиковые чашки Петри диаметром 5 см. Культуры помещали в инкубатор (37°С, в атмосфере 5% С02). В экспериментах использовали культуры, достигшие суб-конфлюентного состояния. За сутки до начала эксперимента клетки переводили на среду ДМЕМ, не содержащую эмбриональной сыворотки.

Стимуляция клеток и приготовление тотальных лизатов. К клеточным культурам после 24 ч сывороточного голодания добавляли ЭФР (100 нг/мл) на 5 и 30 мин. ЭФР выделяли из подчелюстных желез самцов мыши по известной методике [26]. Растворы уабаина (1 мМ) готовили на 0.14 М NaCl. Уабаин ("Sigma", США) вносили в культуры в концентрации 10-7, 10-6, 10-5 или 10-4 М на 5 или 30 мин. После окончания инкубации с добавками культуры помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при +4°С. Культуры промывали 3 раза раствором фосфатно-солевого буфера ^BS) и клетки снимали с чашек в присутствии 0.14 мл лизирующего буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 7.5), 150 мМ NaCl, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ NaF, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% тритон-Х100, 0.5% NP-40, 0.5 мМ PMSF, по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина. Затем клеточные лизаты инкубировали 20 мин при +4°С, пропускали несколько раз через иглу 26G и центрифугировали 15 мин при 16000 g. К су-пернатанту добавляли буфер для электрофорети-ческих проб (1/4 от общего объема: 40 мМ трис-HCI, pH 6.8, 10% SDS, 20% 2-меркаптоэтанола и 40% глицерина) и инкубировали 5 мин при 100°С. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорд [27], используя для построения калибровочной кривой бычий сывороточный альбумин (BSA).

Электрофорез и иммуноблотинг. Белки разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии SDS в модификации Лэммли. Кон-

центрирующий гель (pH 6.8) содержал 4% полиа-криламида. Разделяющий гель (pH 8.8) содержал 7.5% (для идентификации STAT-белков) или 10% полиакриамида (для идентификации белков ERK1/2). Из полиакриламидного геля белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra ("Amersham Pharmacia Biotech", Швеция). Качество переноса оценивали с помощью белкового красителя Ponceau S ("Sigma", США).

Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL Western blotting protocols ("Amer-sham", Великобритания). Инкубацию с антителами против фосфорилированных по тирозину STAT1, STAT3, ERK1/2 проводили при +40С. Все остальные процедуры осуществляли при комнатной температуре. Meмбpaнy промывали TTßS (20 hM трис-HCl, pH 7.5, 150 мМ NaCl и 0.1% Tween-20), после чего инкубировали 1 ч в 5% растворе сухого обезжиренного молока в TTßS, затем в течение ночи в растворе первичных антител в 1-3% растворе BSA в TTBS и промывали TTBS (3 раза по 5 мин). Далее мембрану на 1 ч помещали в раствор вторичных антител в 5% растворе молока в TTBS, после чего промывали TTBS (3 раза по 5 мин).

Для выявления пероксидазной активности конъюгатов GAM-HRP и GAR-HRP использовали реакцию усиленной хемилюминесценции (ECL, "Amersham"). MeM6pa^ промывали водой и инкубировали 1 мин в темноте в свежеприготовленном растворе, содержащем 100 mM трис-HCl (pH 8.5), 1.25 мМ люминола, 0.2 mM кумаровой кислоты и 0.01% H2O2. Хемилюминесцентное свечение регистрировали экспонированием на рентгеновскую пленку CEA RP NEW ("CEA AB", Швеция). Для удаления связавшихся с нитроцеллюлозной мембраной антител и повторной окраски другими антителами мембрану инкубировали в растворе, содержащем 60 mM трис-HCl (pH 6.8), 2% SDS и 100 mM 2-меркаптоэтанола, в течение 30 мин при 500С.

Антитела. Для специфического выявления белков использовали поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по тирозину STAT1 (Tyr 701) и STAT3 (Tyr705) в разведении 1 : 1000 ("Cell Signaling Technology", США), моно-клональные мышиные антитела против N-конце-вых участков STAT 1 и STAT3 в разведении 1 : 500 ("Trasduction Laboratories", США), поликлональ-ные кроличьи антитела на фосфорилированные формы ERK1/2 ("Cell Signaling Technology", США) и поликлональные кроличьи антитела, опознающие нефосфорилированные формы ERK1/2 ("Santa Cruz", США) в разведении 1 : 2000, а также поликлональные козьи антитела против рецептора ЭФР ("Santa Cruz", США) и моноклональные антитела против фосфотирозина ("Cell Signaling Technology", США) в разведении 1 : 1000. В качестве вторичных антител применяли козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгиро-

Вход рубидия, отн. ед. 0.20

0.16

0.12

0.08

0.04

0 10-7 10-

10-

10-4 10-3 Уабаин, M

Рис. 1. Влияние уабаина на вход рубидия в клетках А431. Вход рубидия оценивали по отношению количества рубидия, поступившего в клетки за 30 мин инкубации в среде с рубидием 2.5 мМ), к суммарному количеству одновалентных катионов [К^ + Najn + ЯЬ^] в данной культуре. Уабаин вносили за 1-2 мин до добавления рубидия в культуральную среду. Приведены результаты одного из двух эк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком