БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.841-845
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.3
УЧАСТИЕ АДЕНИЛАТКИНАЗЫ В PЕГУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА ХЛОPОПЛАСТОВ
© 2009 г. И.М. Карташов
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, ПущиноМосковской области
E-mail: Kartashov@issp.serpukhov.su Поступила в p едакцию 09.12.08 г.
И сследовано влияние аденилаткиназы на скор о сти синтеза глюкозо-6-фосфата и восстановления феррицианида в системе, содер жащей хлор опласты, гексокиназу и АДФ в низкой концентрации, при фотофосфор илир овании. Установлено одновременное увеличение скорости восстановления феррицианида и скорости синтеза глюкозо-6-фосфата при добавлении аденилаткиназы в реакционную среду. При этом отношение количества образованного глюкозо-6-фосфата к количеству восстановленного феррицианида близко к единице при увеличении концентрации аденилаткиназы в ср еде. Показано, что в зависимости от вр емени резко возрастают концентрации глюкозо-6-фосфата и восстановленного феррицианида, в то же время существенного падения концентрации AДФ и заметного накопления АМФ доступными нам методами не обнаружено. Отсюда следует, что лимитирующими факторами в этих реакциях являются не концентр ации, а скорости потоков (диффузии) субстратов. Таким обр азом, кажется вер оятным, что с уча стием аденилаткиназы снимаются диффузионные огр аничения в исследуемой системе. Результаты исследований обсуждаются в рамках модели, согласно которой предполагается, что в хлоропластах на уровне функционирования аденилаткиназы посредством прямой и обратной связи челночного типа может осуществляться регуляция диффузии адениннуклеотидов и контроль процесса генерации АТФ в соответствии с его потребностями во взаимосвязи с другими р егулято р ными механизмами.
Ключевые слова: регуляция, хлоропласты, диффузия адениннуклеотидов, аденилаткиназа.
При исследовании биохимических процессов р едко обращают внимание на диффузионные огр аничения суммарной скорости реакции. В то же время эти ограничения возникают, когда каталитическая активность ферментов выше, чем скорость поступления субстратов [1-3]. В работах [4-8] показано, что скорость фотофосфорилирования может лимитироваться диффузией АДФ и эти ограничения в условиях in vitro могут сниматься при повышении концентрации АДФ в ср еде, подключении АТФ-потр ебляющей системы за счет р ецикла АДФ, предварительной адсорбции АДФ на хлоропла-стах, или гипотонической обработке изотонически выделенных хлоропластов. В снятии диффузионных ограничений специфическую роль могут играть фер менты [9-12]. Имеются экспериментальные данные о том, что в снятии диффузионных ограничений адениннуклеотидов в биохимических системах митохондрий животных клеток может принимать участие аденилаткиназа [11,12]. Однако для аденилаткиназы хлоропластов таких данных в доступных литературных источниках нами не обнаружено. Поэтому в данной работе с целью выяснения принципиальной возможности участия аденилатки-
назы в регуляции диффузии адениннуклеотидов в хлоропластах исследовано ее влияние на скорость транспорта АТФ от хлоропластов к гек-сокиназе при нециклическом фотофосфорили-ровании с феррицианидом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали 12-14-дневные про ростки горо ха (Pisum sativum) сорта «Превосходный». Получение ин-тактных хлоропластов, выделение и очистку из них аденилаткиназы осуществляли по описанным ранее методам [13-15]. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури [16]. Cодержание хлорофилла в хлоропластах определяли в 80%-ацетоновом экстр акте по методу Арнона [17]. Аденилаткиназную активность определяли энзиматическими методами [13-15] по количеству образованной АТФ (прямое направление) в системе, сопряженной с гексокиназой и глюкозо-6-фосфатдегидроге-назой, или АДФ (обратное направление) в системе, сопряженной с пируваткиназой и лактат-дегидрогеназой. Для экспериментов использо-
Влияние аденилаткиназы хлоропластов на скорости синтеза глюкозо-6-фосфата и восстановления ферри-цианида
Аденилаткиназа, Ед./мл Скор о сть синтеза глюкозо-6-фосфата, мкмоль на 1мг хлорофилла в ч Скорость восстановления феррицианида, мкмоль на 1 мг хлорофилла в ч Глюкозо-6-фосфат/ во сстано вленный феррицианид
0,0 112 ± 11 109 ± 12 1,02 ± 0,08
5,0 179 ± 14 177 ± 13 1,00 ± 0,05
10 240 ± 15 236 ± 14 1,01 ± 0,09
15 352 ± 12 348 ± 16 1,01 ± 0,07
20 392 ± 14 388 ± 15 1,01 ± 0,07
вали хлоропласты, выделенные по видоизмененной методике Уотли и Арнона [15,18].
Так как в экспериментах глюкозо-6-фосфат, АДФ и АМФ в реакционной ср еде определяли с использованием ферментов, которые сами по себе могут зависеть от доступности адениннук-леотидов [19], то в данной работе использовали метод отбора проб по ходу кинетических измерений. Реакцию начинали добавлением аде-нилаткиназы хлоропластов и включением света, а после ее проведения останавливали добавлением 10% трихлоруксусной кислоты с последующей нейтрализацией реакционной смеси насыщенным раствором Ка2СОз до рН 7,5. От осадка освобождались центр ифугированием при 3000 g в течение 5 мин. В супернатанте спектрофотометрически при з40 нм определяли глюкозо-6-фосфат с использованием глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, АДФ и АМФ-лактат-дегидрогеназы и пируваткиназы по описанному в работе [20] методу для хлоропластов. Для дополнительного контроля и проверки функциональной способности применяемых систем анализа использовали растворы известной концентрации анализируемых соединений и строили калибровочные графики изменений оптической плотности в зависимости от изменения их концентрации в стандартных р астворах. За восстановлением феррицианида следили по уменьшению поглощения при 420 нм. Все спектро-фотометрические измерения проводили на регистр ирующем спектрофотометре Бресогё И У У18. Контрольная среда в конечном объеме 3 мл содержала 120 мкг хлорофилла и следующие реактивы (мкМ): трис-НС1 - 12,5, М§С12 - 2,5; К3[Ре (Сад - 5; КС1 - 100; АДФ - 2,5; Фн -2,5; глюкозу - 20; гексокиназу - 16 ед./мл., рН - 7,8. Освещенность - 90 кэрг/см2 в 1 секунду; температура 20°С. В опытную ср еду добавляли аденилаткиназу. Расчеты скоростей синтеза глюкозо-6-фосфата и восстановления феррицианида проведены по начальным скоростям исходя из линейной зависимости их на-
копления в первые минуты (от 1-5) освещения. В таблице представлены средние данные опытов, полученные на основании не менее пяти определений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В каждом конкретном случае исследования механизмов регуляции тесно связаны с анализом кинетики биологических процессов и начинаются с выбор а экспериментальной системы, включающей предполагаемые механизмы регуляции и позволяющей изучать их кинетическими методами. Для выяснения принципиальной возможности участия аденилаткиназы в регуляции диффузии адениннуклеотидов в хлоропластах, необходимо использовать экспериментальную систему, в котор ой диффузионный режим функционирования процессов генерации АТФ и его потребления искусственно поддерживается только за счет низких концентр аций АДФ в р еакционной ср еде. Такая система была заимствована из работ [6,7], в которых наблюдали ограниченный диффузионный доступ АДФ к Ср1 (сопр ягающий фактор -АТФ -синтаза) и последующую передачу АТФ гексокиназе при низких концентрациях АДФ в ср еде, а также регуляцию электронного транспорта по восстановлению феррицианида при повышении концентрации АДФ [8]. В этой системе, регистр ир уя скоро сти синтеза глюкозо-6-фосфата, можно судить о скоро сти передачи АтФ от С?1 хлоропластов гексокиназе, а по восстановлению феррицианида - о скорости возвр ата АДФ к Ср^ Поэтому выбранная система была использована в качестве основы для проверки влияния аднилаткиназы хлоропластов на диффузионные стадии передачи АТФ от Ср1 хлоропластов гексокиназе и возврата АДФ к Ср1за которыми можно следить, одновременно измеряя скорости синтеза глюкозо-6-фосфата и восстановления феррицианида. При этом выбор низких концентраций АДФ был осуществлен
УЧАCТИЕ АДЕНИЛАТКИНАЗЫ В РЕГУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА 843
на о снове измер ений зависимо сти пр оцесса фо -тофосфо р илир ования от концентр ации АДФ в реакционной среде, позволяющий учесть возможные кинетические о собенности выделенных хлоропластов. Используемая в экспериментах концентрация АДФ находилась в начале линейного участка зависимо сти пр оцесса фото -фосфорилирования от концентраций АДФ в р еакционной ср еде, где диффузионные огр ани-чения могут быть максимальными.
Так как аденилаткиназа, катализирующая обратимую реакцию 2АДФ ^ АТФ + АМФ, пр и выделении хлор опластов в значительной степени тер яется, то ее вносили в реакционную смесь по сле специального выделения из хлор о -пластов. П р и этом, наблюдая за изменениями концентр аций АДФ и АМ Ф в р еакционной среде, можно получить информацию о возможном механизме действия аденилаткиназы в исследуемой системе.
В данной системе (таблица) было установлено одновр еменное увеличение скор о сти восстановления феррицианида и скор о сти синтеза глюкозо-6-фосфата при добавлении аденилат-киназы в реакционную ср еду в условиях фото -фо сфо р илир ования пр и низких концентр ациях А ДФ. П р и этом отношение количества обр а -зованного глюкозо-6-фо сфата к количеству восстановленного феррицианида было близко к единице и со хр анялось пр и увеличении концентр ации аденилаткиназы в ср еде. В зависимо сти от времени в исследуемой системе резко возрастали концентр ации глюкозо-6-фосфата и восстановленного феррицианида, в то же время существенного падения концентр ации АДФ и заметного накопления АМ Ф с использованием указанны х нами методов не обнар ужено. В отсутствие хлор опластов аденилаткиназа не ускоряла синтез глюкозо-6-фо сфата в ср еде, со -держащей АТФ и гексокиназу, что отмечалось и в других источниках [11,12,21].
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
По аналогии с аденилаткиназой митохонд-р ий [11,12] полученные в настоящей работе результаты можно представить в виде схемы (см. рисунок). Регуляция электронного транспорта мембранным потенциалом представляет собой «фотосинтетический» контроль, при котором утилизация АТФ влияет на генерацию АТФ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.