БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 387-397
УДК 577
УЧАСТИЕ АКТИВИРОВАННОГО ПРОТЕИНА С И ТРОМБИНА В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ АСТРОЦИТОВ
© 2013 г. А. Е. Иванова1*, Л. Р. Горбачева1, 4, С. М. Струкова1, В. Г. Пинели^, Г. Райзер3
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12; *электронная почта: iris151@mail.ru 2Научный центр здоровья детей РАМН, 119991, Москва, Ломоносовский просп., 2, стр. 1 3Институт нейробиохимии, медицинский факультет, университет Отто-фон-Герике, Магдебург, Германия 4Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова МЗ РФ,
117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Поступила в редакцию 02.05.2013 г.
Антикоагулянтная система протеина С является мультифункциональной кофактор-зависимой системой. Кроме антисвертывающей функции у активированного протеина С (АПС) было обнаружено нейропротекторное действие в условиях гипоксии и инсульта, однако возможные эффекты АПС на функции астроцитов раннее не исследовались. В настоящей работе произведена оценка изменения состояния культивируемых астроцитов крысы под действием тромбина и АПС. Установлено, что тромбин в концентрациях выше 10 нМ вызывает активацию культивируемых астроцитов и приводит к развитию астроглиозиса. Через 24 ч после воздействия тромбина в культивируемых астро-цитах крысы наблюдается активация процесса пролиферации и возрастание экспрессии белка S100b. Тромбин в высоких концентрациях вызывал изменение цитоскелета астроцитов, в частности, повышение количества стресс-фибрилл в культивируемых клетках. Тромбин, вероятно, влияет и на миграцию астроцитов. Так, присутствие тромбина в среде культивируемых астроцитов приводило к изменению равномерности клеточного монослоя и образованию пустых полей ("free fields"). Показано, что АПС предотвращает вызванную тромбином пролиферацию астроцитов и экспрессию белка S100b, снижая данные показатели до уровня контрольных значений. Кроме этого, АПС снижает вызванную тромбином дезорганизацию фибрилл и образование "free fields". Таким образом, в настоящей работе продемонстрирован новый аспект протекторного действия АПС как фактора, супрессирующего активацию астроцитов, вызванную провоспалительным действием тромбина. Результаты проведенного исследования указывают на возможную перспективу использования АПС как регулятора астроглиозиса при патологических состояниях мозга.
Ключевые слова: астроглиозис, тромбин, активированный протеин С (АПС), стресс-фибриллы, S100b, "free fields"
Б01: 10.7868/80233475513050046
Астроциты являются одним из главных компонентов центральной нервной системы. Астроглия участвует в формировании гематоэнцефаличе-ского барьера (ГЭБ), в метаболических процессах в нервных клетках, поддерживает концентрацию электролитов в межклеточном пространстве и т.д. [1—3]. Астроциты реагируют на различные повреждения мозга. Развивающийся при этом реактивный астроглиозис характеризуется высокой скоростью пролиферации астроцитов, а также их серьезными морфологическими и функциональными изменениями, например повышением содержания белка 8100Ъ. Реактивный астроглиозис возникает при разных вирусных заболеваниях, энцефалопа-тиях, в результате травм мозга, при нейродегене-
ративных состояниях (например, болезни Альц-геймера) [4—6]. Многочисленные исследования указывают на связь хронической активации глии (астроцитов и микроглии) и последующих прогрессирующих циклов нейровоспаления, аутоиммунных реакций и нейродегенерации. Хроническую воспалительную активацию глии вызывают цитокины (1Ь-1, ТМБ-а), липополисахарид, р-амилоид-42 и другие стимулы [7]. Активация астроцитов усугубляет течение основной болезни, способствует прогрессированию хронических нейродегенеративных заболеваний [8]. На данный момент развитие астроглиозиса при острых нарушениях мозговой деятельности остается серьезной проблемой в медицинской практике, по-
скольку плохо изучены конкретные способы корректировки астроглиозиса. В связи с этим остро встает вопрос поиска как веществ, запускающих астроглиозис, так и соединений, снижающих развитие данного патологического состояния.
При черепномозговых травмах, эпилепсии, инсульте и других патологических состояниях работа ГЭБ нарушается, что может приводить к появлению во внеклеточном пространстве мозга высоких концентраций тромбина [9—12]. Тромбин — полифункциональная сериновая протеи-наза семейства трипсина — играет ключевую роль в системе свертывания крови. Помимо процесса свертывания, тромбин участвует в регуляции многих физиологических и патофизиологических процессов, таких как фибринолиз, тромбо-образование, воспаление, атерогенез, канцерогенез, нейродегенеративные заболевания [12—15]. Было показано, что активация рецептора тромбина PAR-1 в астроцитах играет ключевую роль в формировании глиального рубца [9]. PAR-рецеп-торы, которых насчитывается 4 подтипа, экс-прессируются многими клетками, в том числе глиальными и нейронами [16]. Ряд исследований показал, что тромбин, действуя через PAR-1 рецептор на астроцитах, стимулирует пролиферацию клеток путем запуска MAPK-каскада (mito-gen-activated protein kinase) [17, 18].
В последнее время внимание исследователей привлекает другая сериновая протеиназа гемостаза — активированный протеин С (АПС). Антикоа-гулянтная система протеина С является мульти-функциональной кофактор-зависимой системой. АПС способен оказывать цитопротекторное, ан-тиапоптотическое и противовоспалительное действие [19—21].
Механизмы противовоспалительного действия АПС могут быть различны [22]. Прямое противовоспалительное действие АПС обусловлено его способностью блокировать провоспали-тельные ответы клеток. АПС снижает продукцию цитокинов (в частности IL-1p, IL-6, IL-8), адгезивных молекул, ряда транскрипционных факторов, что приводит к подавлению начальных стадий воспаления [16, 23]. Показано, что АПС является нейропротектором в условиях глутаматной эксайтотоксичности и в гипоксическом эндотелии мозга [24]. Специфическое противовоспалительное и протекторное действие АПС осуществляет через PAR1 (активируемый протеиназами рецептор 1) и EPCR (эндотелиальный рецептор протеина С), локализующийся преимущественно в эндотелиальных клетках, но недавно обнаруженный и в нейронах [25, 26].
Однако данные о влиянии АПС на астроциты отсутствуют в литературе, что в виду противовос-
палительных и протективных эффектов AПС делает исследование данного вопроса актуальным. Целью настоящей работы было изучить влияние AПС на вызванную тромбином активацию астро-цитов в первичной культуре.
MAТEPИAЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. При выполнении данной работы были использованы следующие вещества: KH2PO4, NaH2PO4, №2НРО4 • 12Н2О, пенициллин/стрептомицин (Invitrogen, СШA), MTT (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолийбромид), инактивированная эмбриональная телячья сыворотка HI FBS (Invitrogen, СШA), ДНКаза (Sigma, СШA), раствор Хенкса без кальция и без магния HBSS -Ca2+, -Mg2+ (Invitrogen, СШA), трипсин (Invitrogen, СШA), DMEM с высоким содержанием глюкозы, с пируватом и GlutaMax (Invitrogen, СШA), PSA (персульфат аммония, Sigma, СШA), 4% параформальдегид, DMSO, активированный протеин С (Sigma, СШA), тромбин (Sigma, СШA), фаллоидин (Alexa Fluor 546, Invitrogen, СШA), ДНК-тропный краситель Syto-59 (Molecular Probes, Invitrogen, СШA). Aнтитела: кроличьи поликлональные анти-S100b антитела (Dako, Германия), кроличьи моноклональные ан-ти-S100b антитела (Novus biologicals, СШA), козлиные анти-EPCR антитела (Santa Cruz, СШA), анти-GAPDH антитела (Millipore, CШA), анти-GFAP антитела (Millipore, СШA); вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Dianova, Hamburg, Germany), вторичные антитела против кролика (Alexa Fluor 488, Invitrogen, СШA) и против козла (Alexa Fluor 546, Invitrogen, СШA).
Все опыты с животными производились согласно этическим принципам и нормативным документам, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном обращении с животными.
Получение первичной культуры астроцитов.
Работа проводилась на 2-3-недельной первичной культуре астроцитов. Aстроциты выделялись из мозга новорожденных или 1—2-дневных крысят линии Вистар. Крысят декапитировали, извлекали головной мозг, выделяли кортекс и измельчали скальпелем. Измельченный кортекс переносили в раствор папаина 5 U/мл (Sigma, СШA) и инкубировали при 37°С в течение 7—8 мин. По истечении времени инкубации раствор папаина аккуратно отбирали, к осевшим клеткам добавляли раствор Хенкса без Са2+ и Mg2+ с добавлением ДНКазы (0.01 мг/мл). Для более тщательной отмывки клеток от папаина раствор Хенкса несколько раз отбирали и добавляли заново. Затем клетки суспендировали и пропускали через нейлоновое сито. Суспензию клеток центрифугировали
(500 §, 7 мин, 4°С), осадок разводили в среде DMEM (1пукго§еп, США), с добавлением 100 и/мл пенициллина/стрептомицина и 10% инактивиро-ванной эмбриональной телячьей сыворотки (1п-уИго§еп, США). Суспензию с клетками рассеивали в культуральные флаконы и инкубировали в течение 10—12 дней при 37°С, 5% С02. При каждой смене питательной среды флаконы встряхивали на шейкере при комнатной температуре в течение 5—10 мин для удаления олигодендроцитов и микроглии. После инкубации астроциты снимали с флаконов 0.25% раствором трипсина в фосфатно-солевом буфере (1пуИго§еп, США) и пересаживали в чашки с прикрепленными стеклами (МаЯек, США) или в ячейки 6-, 24-, 48-лу-ночных плейтов. Далее астроциты держали при 37°С в 5% С02 инкубаторе в течение 4—10 дней. Однородность культуры астроцитов составляла более 90% при окрашивании антителами к специфическому глиальному фибриллярному кислому белку GFAP [4, 14].
По истечении срока культивирования культу-ральная среда в планшетах и в чашках со стеклами менялась на бессывороточную, кроме группы положительного контроля. Астроциты в бессывороточной среде инкубировали в течение 1—3 ч. Затем добавляли в соответствующие экспериментальные лунки или на стекла тромбин до конечной концентрации 1 нМ, 10 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 1 мкМ и/или АПС до кон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.