БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 2, с. 316 - 325
УДК 577.2.04
УЧАСТИЕ ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ В ИНДУКЦИИ БИОГЕНЕЗА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ТИРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ
© 2011 г. М.В. Патрушев*, В.Е. Патрушева
ФГОУВПО Российский государственный университет им. И. Канта, 236041 Калининград, ул. А. Невского, 14; электронная почта: maxpatrushev@gmail.com
Поступила в редакцию 13.07.10 После доработки 19.09.10
Тироидные гормоны являются экзогенными регуляторами клеточного метаболизма, в который, наряду с другими системами клетки, вовлечены митохондрии. Механизмы влияния тироидных гормонов на биогенез мтДНК полностью не раскрыты в силу их плейотропного действия. В литературе обсуждаются различные пути регуляции митохондриального биогенеза тироидными гормонами, главными звеньями в которых являются тироидные рецепторы, локализующиеся как в ядре, так и в митохондриях. Данные о событиях, происходящих после активации рецепторов, достаточно противоречивы. Мы исследовали степень вовлечения митохондриальных факторов транскрипции в биогенез мтДНК, индуцированный трийодтиронином. Оценен вклад TFAM, TFB2M и хеликазы Twinkle в тироид-индуцированный биогенез мтДНК. Показано, что для индукции биогенеза мтДНК необходима активация экспрессии TFAM и TFB2M. Роль хеликазы Twinkle, индукция экспрессии которой также наблюдается при добавлении трийодтиронина, остается неясной. Исследования факторов, активирующих экспрессию TFAM и TFB2M, показали, что NRF-1 является определяющим регулятором: дефицит этого фактора способствовал развитию полного коллапса системы биогенеза мтДНК. В то же время, дефицит коактиватора транскрипции PGC-1a не приводил к значимому снижению тироид-индуцированного биогенеза, в то время как данные литературы указывают на его ключевую роль в биогенезе митохондрий. Таким образом, в данной работе на модельной системе впервые продемонстрирована роль основных факторов транскрипции в биогенезе мтДНК, индуцированном трийодтиро-нином.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: мтДНК, трийодтиронин, тироидные гормоны, факторы транскрипции, биогенез.
Митохондрии млекопитающих и человека имеют собственную ДНК, которая кодирует 13 полипептидов, составляющих мультифермент-ный комплекс электрон-транспортной цепи, 22 транспортные РНК и две рибосомные РНК. Биогенез мтДНК не зависит от клеточного цикла, все факторы, обеспечивающие транскрипцию и репликацию мтДНК, кодируются в ядре. Регуляция функционирования мтДНК во многом зависит от экзогенных факторов, основными из которых являются гормоны. Роль тироидных гормонов требует отдельного внимания, так как они играют ключевую роль в энергетическом метаболизме. Ранее было показано, что гипоти-роидизм приводит к уменьшению статистического уровня мтРНК, в особенности мРНК, что изменяет соотношение мРНК/рРНК [1]. Эффект достигается низкими концентрациями гормонов и носит насыщаемый характер [2]. В ряде работ описан рецептор, локализованный в
* Адресат для корреспонденции.
митохондриях, способный после взаимодействия с гормонами влиять на биогенез мтДНК [3, 4]. Митохондриальный ТЗ-рецептор, лиган-дами для которого являются тироидные гормоны, играет важную роль в протонном транспорте, вовлечен в регуляцию продукции тепла митохондриями, что отражается на стабильности и функционировании мтДНК [5]. Однако главной мишенью тироидных гормонов являются транскрипционные факторы ядерной ДНК, часть из которых может прямо или опосредованно регулировать транскрипцию и репликацию мтДНК. Среди этих факторов особо стоит выделить ядерный ТЗ-рецептор, для которого продемонстрирована регуляторная роль в отношении большого количества траскрипционных факторов. Транскрипция и, как следствие, репликация мтДНК зависит, главным образом, от нескольких основных факторов: TFAM, TFB2M, POLG, Twinkle, mtRNApol. Показано, что среди перечисленных факторов, TFAM является ключевым игроком в регуляции транскрипции
мтДНК и координации ее с экспрессией ядерных генов [6]. Однако некоторые наблюдения подтверждают главную роль этого белка в регуляции уровня мтРНК. TFAM — это белок, присутствующий в большом количестве [6], и уменьшение его уровня в гетерозиготных нока-утных мышах приводит к резкому падению уровня мтДНК во всех тканях, но не мтРНК [7]. Очевидно, что регуляция биогенеза мтДНК ти-роидными гормонами может осуществляться как через митохондриальный ТЗ-рецептор, так и через активацию ядерных факторов транскрипции. В свою очередь, регуляция экспрессии TFAM, TFB2M и Twinkle может осуществляться как непосредственно тироидными рецепторами после их взаимодействия с лигандами, так и через активацию NRF-1 — универсального позитивного регулятора экспрессии генов, вовлеченных в функционирование митохондрий. В качестве коактиватора транскрипции, в литературе рассматривается PGC-1a, который выполняет функцию посредника между тироидными рецепторами и NRF-1 [8]. Целью данной работы является установление каскада факторов белковой природы, участвующих в биогенезе мтДНК, индуцированном важнейшим из тироидных гормонов — трийодтиронином.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клеточную линию фибробластов мышей культивировали в среде DMEM, содержащей 6%-ную сыворотку в атмосфере СО2 (5%).
Выделение ДНК. К осажденным клеткам добавляли 300 мкл лизирующего раствора (4 М гуа-нидин-тиоционат, 25 мМ натрий цитрат, рН 7,0, 0,5%-ный саркозил) перемешивали, вносили 15 мкл 2М Tris-HCI, рН 8,0, 30 мкл 4 М NaCI, 600 мкл фенола, насыщенного Tris-HCI, рН 8,0, 120 мкл хлороформа, гомогенезировали, оставляли в холодильнике на 20 мин, после чего осаждали в течение 3 мин при 6000 об/мин на центрифуге «Eppendorf 5415». Отбирали верхнюю фазу, добавляли два объема 96%-ного этанола и оставляли при —20° на ночь. Осадок после центрифугирования в течение 7 мин при 13 000 об/мин дважды промывали 70%-ным спиртом, подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл ТЕ (10 мМ Tris-HCI, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА).
Выделение РНК. К осажденным клеткам добавляли 10 объемов лизирующего буфера, содержащего 0,1 М ß-меркаптоэтанола. К лизату добавляли 1/10 объема 3 M AcONa, pH 5,0 и 1 часть водонасыщенного (кислого) фенола. Перемешивали, инкубировали 5—10 мин при комнатной температуре. Добавляли 1/5 объема смеси
хлороформ—изоамиловый спирт 24 : 1. Перемешивали, инкубировали 15 мин при +4°. Центрифугировали 5 мин при 10 000 g. Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли 1 объем смеси хлороформ—изоамиловый спирт. Перемешивали, центрифугировали 5 мин при 10 000 g. Водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли 0,8 объема изопропанола. Инкубировали 12 ч при —20°. Центрифугировали 10 мин 13 000 g при +4°. Осадок РНК трижды промывали 70%-ным этанолом. После высушивания РНК растворяли в воде обработанной DEPC.
Синтез первой цепи кДНК осуществляли по следующей процедуре: смешивали 2 мкл мРНК и 1 мкл oligo-d(T)18 праймера. После инкубации в течение 5 мин при +70° смесь помещали в лед и затем добавляли буфер, содержащий 10 мМ Tris-HCl, pH 8,3, 50 мМ KCl, 0,2 мМ dNTPs, 1,6 мМ Mg2+, и перемешивали. К смеси добавляли 1 мкл RNAsinTM («Fermentas») и 1 мкл (200 ед.) H-MinusTM M-MuLV обратной транскриптазы («Fermentas»). Смесь инкубировали 30 мин при +40°. Реакцию останавливали нагреванием при 95° в течение 10 мин.
ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для амплификации ДНК и кДНК использовали ПЦР-РВ (для оценки количества ДНК) и обратно-тран-скриптазную ПЦР-РВ (для оценки количества мРНК). ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ проводили с использованием систем для детекции ПЦР — продуктов в реальном времени: CFX96 («Bio-Rad»). Система ПЦР-РВ и ОТПЦР-РВ включала технологию TaqMan, основанную на 5'-экзонукле-азной активности Taq-полимеразы. Зонды были мечены флуорофором на 5'-конце и тушителем на 3'-конце. Все реакции ПЦР-РВ проводили в буфере, содержащем 10 мM Tris-HCl, pH 8,3, 50 мM KCl, 0,25 мM dNTPs, 2,5 мM Mg2+, 300 нM каждого праймера и 150 нМ каждого зонда, 1,5 ед. Taq-полимеразы (таблица).
Для абсолютной количественной оценки применяли калибровочные графики с точками пересечения ACt со значениями концентраций вектора pGEM-T Easy, содержащим анализируемый фрагмент и тем же вектором с фрагментами амплифицируемых референтных генов.
ACt = Q; анализируемого фрагмента — срО значений референтных генов.
срО =
üCt (ß — actin, (3 — globin, gapdh) 3
Синтез малых интерферирующих НК и нгиби-рование трансляции. Матрицей для синтеза малых интерферирующих РНК (миРНК) служили
Праймеры и зонды для количественной оценки мРНК
Наименование гена Последовательность 5'-3'
nd2 F R Probe TTGCCATTATCTACTTCACAA GTTGCTTATAGTTGAGTACGA F-TCAGCCTACTAGCAATTATCCC-Q
nd4 F R Probe ATGGCCTCACATCATCA GGCTTGCAATCAGTCAT F-TCGGGCCATAATTATAGTACGG-Q
coli F R Probe CTGCCAATAGAACTTCC TGGCCATAGAATAATCCT F-CAGGCCGACTAAATCAAGCAA-Q
nd5 F R Probe CCCCTAATCTCCATTAACG GTGGGATATTATATGAGATGACAA F-CCTGCAAAGATGCTTCCG-Q
coI F R Probe CCCCAGATATAGCATTCCCA GCACCTAAAATAGACGACA F-CCGGAAATCTAGCCCATGCAG-Q
TFAM F R Probe GCCCTTAGAGAACTCATGG AGGCAAGTTTTCTACCCA F-ATGCGTTCTTCTGTTCCTACCTT-Q
TFB2M F R Probe CTGCCGTAGATCAATGGTA ACGTGTGCAAAAGAATCCTG F-CCAGCAAGAATGACGCCAC-Q
Twinkle helicase F R Probe ACGGTATCTGCAGGTGTCCAA GGCCACTAGTCCATTGTCGTCC F-ACCCAAGAGCAAAGCCCGACTCA-Q
NRF-1 F R Probe CGCCACAGGAGGTTAATTCAGA CGACCTGTGGAATACTTGAGC F-CTGCCGCCTCTCACCATCG-Q
Actin beta F R Probe CGGGACCTGACAGACTACCTC AGCACAGCTTCTCTTTGATGTCAC F-ACCGAGCGTGGCTACAGCTT-Q
Globin beta F R Probe TGCTGGTTGTCTACCCTT GGCCTTCACTTTGGCATT F-CCCAGCGGTACTTTGATAGCTT-Q
gapdh F R Probe CCGCATCTTCTTGTGCAG TGTGCCGTTGAATTTGCC F-ACGACCCCTTCATTGACCT-Q
амплифицированные фрагменты ДНК, соответствующие 5'-UTR целевых мРНК. После амплификации с использованием частично гибриди-зующихся олигонуклеотидов и Тад-полимеразы к ампликонам достраивали промотор для Т7-по-лимеразы. Затем проводили синтез миРНК с помощью набора реагентов TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit («Fermentas») в соответствии с инструкцией производителя. Расщепление ДНК проводили ДНКазой I («Fermentas»). Далее миРНК осаждали 96%-ным этанолом в присутствии 200 мМ LiCl, центрифугировали 16 000 g — 10 мин при 4°. Осадок трижды промывали 70%-ным этанолом, растворяли в 50 мкл деионизов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.