БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 4, с. 292-300
УДК 577.352.465; 576.321.36
УЧАСТИЕ КАЛЬЦИЙ-НЕЗАВИСИМОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ A2 В РЕГУЛЯЦИИ Са2+-СИГНАЛА, ВЫЗВАННОГО ИНГИБИТОРОМ КАЛЬМОДУЛИНА В ТИМОЦИТАХ КРЫСЫ
© 2008 г. А. С. Ефремова, В. П. Зинченко
Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино Московской области; ул. Институтская, 3; факс: (4967) 33-0509; электронная почта: vpz@mail.ru Поступила в редакцию 17.03.2008 г.
Ранее показано, что ингибитор кальмодулина калмидазолий в микромолярных концентрациях кратковременно активирует неселективный Са2+-канал в плазматической мембране клеток асцитной карциномы Эрлиха [Зинченко В.П. и др. Биофизика. 2005. T. 50. № 6. С. 1055-1069]. В настоящей работе с целью обнаружения Са2+-каналов данного типа в других клетках и выявления общих механизмов их регуляции изучено действие калмидазолия на тимоциты крысы. Показано, что калмидазолий вызывает двухфазное повышение содержания Са2+ в цитозоле тимоцитов. Обе фазы обусловлены входом Са2+ снаружи и отражают активность неселективных Са2+-каналов, проницаемых для Mn2+ и Ni2+. Скорость и амплитуда быстрой фазы уменьшаются, а медленной фазы возрастают в присутствии специфических ингибиторов Са2+-независимой фосфолипазы A2 - броменоллактона и пальмитоилтри-фторметилкетона. Скорость и амплитуда быстрой фазы подавляется также арахидоновой кислотой, ингибитором липоксигеназы нордигидрогуаретиковой кислотой и не подавляется ингибитором Са2+-зависимой фосфолипазы A2 - бромфенацилбромидом, ингибитором циклооксигеназы индометаци-ном, специфическим ингибитором SOC-каналов гадолинием, ингибитором фосфолипазы С U73122. Скорость быстрой фазы слабо зависит от температуры. Скорость медленной фазы сильно зависит от температуры и растет при повышении температуры с Q10 = 2. Амплитуда быстрой фазы Са2+-сигнала возрастает при понижении температуры за счет увеличения времени максимальной активности канала. Полученные данные указывают, что Са2+-независимая фосфолипаза A2 (iPLA2) является промежуточным звеном в пути активации калмидазолий-индуцированного неселективного Са2+-канала. Предполагается, что продукты iPLA2 (лизофосфолипид и арахидоновая кислота) действуют как активатор и ингибитор канала соответственно. Они имеют различное сродство к нему, что объясняет механизм двухфазного повышения концентрации Са2+ в цитозоле тимоцитов и увеличение времени нахождения канала в активном состоянии при понижении температуры.
Множество ключевых процессов в невозбудимых клетках требуют поддержания увеличенной концентрации Ca2+ длительное время, что может быть достигнуто только через активацию входа Ca2+ в клетку. Главный путь входа Ca2+ в эти клетки - каналы, регулируемые запасом Ca2+ во внутриклеточных структурах (SOC-каналы). В настоящее время очевидно, что SOC-каналы представляют собой семейство Ca2+-каналов, обладающих различными свойствами. В 1993 г. впервые предположили [1], что существовует низкомолекулярный фактор CIF (Ca2+ influx factor), способный активировать вход Ca2+ в невозбудимых клетках. Вскоре было показано, что действие CIF может
Сокращения: АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха; ЭР - эн-доплазматический ретикулум; R24571 - калмидазолий; iPLA2 - Ca2+-независимая фосфолипаза A2; BEL - броме-ноллактон; PACOCF3 - пальмитоилтрифторметилкетон; АА - арахидоновая кислота; NDGA - нордигидрогуаретико-вая кислота; SOC-каналы - store operated calcium channels; BPB - 4-бромфенацилбромид; РМСА - Ca^-АТР-аза плазматической мембраны; LOX - липоксигеназа; [Ca2+]i - концентрация ионов кальция в цитозоле; Диг - дигитонин.
быть обусловлено активацией, Са2+-независимой фосфолипазы А2 (дРЬА2) [2]. При активации 1РЬЛ2 образуются два короткоживущих вторичных мес-сенджера: лизофосфолипид и арахидоновая кислота (АА). Показано, что лизофосфолипиды лизо-фосфотидилхолин, лизофосфатидилинозит и ли-зофосфатидилсерин являются активаторами Са2+-каналов плазматической мембраны [2-5], а АА проявляет свойства ингибитора некоторых БОС-каналов [6-8], в том числе в тимоцитах [9, 10]. Кроме того описано стимулирующее действие АА на активность РМСА [11, 12]. В качестве прямого активатора ¡РЬЛ2 можно использовать калмидазолий, ингибитор кальмодулина [2]. Калмидазолий образует комплекс с кальмодулином ¡РЬЛ2, что приводит к изменению конформации и активации фермента [2, 5].
Повышение концентрации ионов кальция в цитозоле ([Са2+];) при действии калмидазолия наблюдали на многих типах клеток [13-16]. Показано, что при этом активируется неселективный Са2+-канал плазматической мембраны [7]. Свойства и
механизмы регуляции этого канала ранее изучали на клетках асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) [17]. Эти исследования выявили "побочное" действие калмидазолия, обусловленное ингибирова-нием Са2+-АТР-азы плазматической мембраны (РМСА). Ингибирование РМСА приводит к повышению стационарного уровня Са2+ в цитозоле, что осложняет анализ Са2+-сигнала. С другой стороны, калмидазолий ингибирует активность селективных Са2+-каналов [18], что дает возможность выделить Са2+-сигнал, обусловленный вкладом неселективных каналов. С целью установления общих механизмов регуляции Са2+-каналов этого типа в различных клетках нами проведены исследования на тимоцитах. Тимоциты в отличие от клеток АКЭ не имеют развитого эндоплазматического ретикулума (ЭР) и обладают слабой активностью РМСА, что приводит к высокой чувствительности этих клеток к Са2+-агонистам [19]. Измеряя изменения [Са2+Ь мы выявили калмидазолий-активиру-емые неселективные Са2+-каналы в плазматической мембране тимоцитов и исследовали участие продуктов iPLA2 в регуляции их активности.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы. В работе использованы: дигито-нин, РАСОСТз ("СаШоеИеш", США); EGTA, HEPES, NDGA, ВРВ, АА, калмидазолий, BEL, среда Хенкса ("Sigшa", США); АТР ("1С№' США); In-do-1AM, ("Molecukr Probes", США).
Измерения проводили в среде Хенкса, содержащей (мМ): №С1 - 140, КС1 - 5.4, СаС12 - 1.3, MgSO4 -1, KH2PO4 - 1, NA2HPO4, NaHCO3 - 1, глюкозу - 6, HEPES - 10, pH 7.2. Бескальциевая среда представляла собой стандартный солевой буфер без добавленного Са2+, содержащий 0.5 мМ EGTA. Концентрация свободного Са2+ в этой среде составляла менее 0.1 мМ.
Объектом исследования служили тимоциты крысы. Тимоциты получали из декапитированных крыс линии Wistar (120 г) продавливанием тимуса через нейлоновое сито в среду Хенкса. После этого клетки дважды промывали и ресуспедировали в той же среде.
Флуоресценцию суспензии клеток измеряли в термостатируемой ячейке с перемешиванием. Концентрация клеток в ячейке объемом 2 мл - 3 х х 106 клеток в 1 мл. Уровень [Са2+] в клетках измеряли по отношению интенсивностей флуоресценции зонда Indo-1 при 405 и 490 нм (длина волны возбуждения - 365 нм) [20]. Суспензию клеток инкубировали с 4 мкМ Indo-1 AM и 0.005% Pluronic F127 в течение 40 мин при 37°С. Клетки дважды отмывали охлажденной средой Хенкса. [Са2+] рассчитывали, как описано ранее [20, 21], используя величину константы связывания красителя с Са2+, равную 250 нМ при 37°С. Изменение Kd при изме-
нении температуры учитывали в линейном приближении, исходя из известных значений Kd - 250 и 230 нм для 37 и 22°С соответственно. Чтобы учесть зависимость интенсивности флуоресценции красителя от температуры, интенсивность флуоресценции при насыщающих концентрациях Ca2+ и данной температуре принимали за 1. Транспорт Ni2+ оценивали по тушению флуоресценции клеток, окрашенных Indo-1 в области изобестической точки 445 нм. Эксперименты выполнены на установке, специально сконструированной для флуоресцентных исследований суспензий клеток и органелл [22]. Установка представляет собой комплекс микрофлу-ориметра и сложной термостатируемой ячейки с магнитной мешалкой. Особенностью флуориметра является использование высокоаппертурной контактной оптики, обеспечивающей фокусировку возбуждающего света в небольшом объеме постоянно перемешиваемой суспензии. Для регистрации сигналов использовали компьютерную программу Record 4, а для обработки результатов и построения графиков - программу Origin-7.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика Са2+-сигнала, индуцированного калмидазолием. Ранее мы показали, что калмидазолий в микромолярных концентрациях кратковременно активирует неселективный Са2+-про-ницаемый канал в плазматической мембране клеток АКЭ [5, 17]. В Т-лимфоцитах ингибитор кальмодулина вызывает более сложное, двухфазное повышение [Ca2+]i в цитозоле с выходом на плато (рис. 1а).
Повышение [Ca2+]i обусловлено активацией входа Са2+ снаружи, поскольку в бескальциевой среде оно отсутствует (не показано). Вход Са2+ происходит за счет активации неселективных Са2+-каналов, проницаемых для Mn2+ и Ni2+. На рис. 1а показано, что калмидазолий вызывает двухфазный вход Ni2+ в клетку, который прекращается через 3 мин. На рис. 16 приведены изменения скоростей входа Са2+ и Ni2+ при действии калмидазолия (первые производные графиков рис. 1а). Профили скоростей входа Са2+ и Ni2+ совпадают, что указывает на отсутствие заметного вклада Са2+-селек-тивных каналов в формирование сигнала. Аналогичные данные получены и с Mn2+. Время достижения максимальной активности канала составляет 7-10 с. Затем активность канала мало меняется в течение 10 с. Через 20 с скорость входа Са2+ резко уменьшается на короткое время, а затем снова возрастает и медленно уменьшается. Время полной инактивации транспорта составляет 3 мин. К этому моменту скорости входа Са2+ и Ni2+ уменьшаются до нуля, однако [Са2+] остается повышенной, указывая на ингибирование калмидазолием РМСА, что ранее наблюдали и на клетках другого типа [23-26]. Таким образом, калмидазолий вызыва-
Флуоресценция Indo-1, отн. ед.
1.0 I-_ а
0 120 Скорость, отн. ед.
0.01
240
360
-0.01
120
240 Время, с
Рис. 1. а - Повышение [Са2+] тимоцитов (1) и тушение флуоресценции Мо-1 при транспорте №2+ (2) при действии 1 мкМ Я24571. Здесь и далее концентрация клеток - 3 х 106/мл, дигитонина - 0.003%; интенсивность флуоресценции в присутствии дигитонина принята за 1, а начальный уровень за 0. Для кривых с №2+ исходный уровень флуоресценции принят за 1, а уровень полного тушения в присутствии д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.