ш
УДК 577.27:577.352.335
УЧАСТИЕ КАСПАЗ В КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ GD2-СПЕЦИФИЧНЫМИ АНТИТЕЛАМИ
© 2014 г. П. А. Вишнякова*, И. И. Доронин*, И. В. Холоденко*, **, Д. Ю. Рязанцев*,
И. М. Молотковская*, Р. В. Холоденко*, #
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **ФГБУ "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича" Российской академии медицинских наук, 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8
Поступила в редакцию 23.10.2013 г.
Принята к печати 13.11.2013 г.
Изучен вклад основных каспаз в цитотоксические эффекты, вызываемые моноклональными антителами 1402а, специфичными к опухолеассоциированному ганглиозиду ОБ2, в клетках мышиной лимфомы БЬ-4. Зарегистрирована конститутивная экспрессия генов прокаспаз в клетках ББ-4. Так, инкубация клеток с антителами 1402а не приводила к значимому увеличению синтеза прокаспаз, не усиливалась также их ферментативная активность, что было показано с использованием флуоресцентно-меченых субстратов каспаз. При одинаковом уровне клеточной гибели активность кас-пазы-3 и каспазы-9 в клетках, инкубированных с антителами 1402а, в 7.5 и в 3 раза ниже, чем в клетках, обработанных стауроспорином. Общий ингибитор каспаз (/-УАО-БМК), а также ингибитор каспазы-3, уменьшали цитотоксические эффекты, индуцированные антителами 1402а, на 9—16% и 6—13% соответственно. В тех же условиях уровень апоптоза, индуцированного стауроспорином, падал на 55—65%. Ингибиторы инициаторных каспаз-8 и -9 не влияли на клеточную гибель, запускаемую антителами. Ингибиторный анализ показал также, что каспазы не участвуют в запуске первых этапов клеточной гибели, индуцированной антителами 1402а, проявляющихся в уменьшении клеточного объема и в нарушении проницаемости плазматической мембраны. Таким образом, каспазы не играют ключевую роль в клеточной гибели, индуцированной антителами к 0Б2, их незначительная ферментативная активность не определяет механизм гибели клеток, опосредованной воздействием на опухолеассоциированный ганглиозид 0Б2.
Ключевые слова: ОБ2, опухолеассоциированные ганглиозиды, каспазы, клеточная гибель, апоптоз, мо-ноклональные антитела.
БОТ: 10.7868/80132342314030154
ВВЕДЕНИЕ
Онкоассоциированный ганглиозид GD2 является маркером ряда онкологических заболеваний [1]. Этот сиалированный гликосфинголипид гипер-экспрессируется на плазматической мембране
Сокращения: 7-AAD — 7-аминоактиномицин D; AVD — апоптозиндуцированное уменьшение клеточного объема; FBS — сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота; МТТ — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий-бромид; FITC — Fluorescein Isothyocyanate, флуоресцеинизо-тиоцианат; HEPES — 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этилсульфоновая кислота; PI — иодистый пропидий; siRNA — малые интерферирующие РНК; Z-VAD-FMK — общий ингибитор каспаз; Z-DEVD-FMK/AFC — ингибитор/субстрат каспазы-3; Z-IETD-FMK/AFC — ингибитор/субстрат каспазы-8; Z-LEHD-FMK/AFC — ингибитор/субстрат каспазы-9; анти-GD2-мАт — GD2-специфичные монокло-нальные антитела, PBS — забуференный физиологический раствор.
#Автор для связи (тел.: +7 (495) 330-72-56, эл. почта: khol@mail.ru).
клеток таких опухолей, как нейробластома, глиома, меланома, мелкоклеточный рак легких, лим-фома и ряде других. Современные подходы к лечению рака, основанные на применении новых вакцин [2], цитокинов [3], адресной доставки хи-миопрепаратов и 81ЯМЛ в составе липосом [4] и наночастиц [5] к раковым клеткам, в терапии 002-позитивных опухолей зачастую оказываются неэффективными. Ассоциированность ган-глиозида СЭ2 с опухолевыми клетками и ограниченная экспрессия на нетрансформированных клетках делает его привлекательной мишенью для противоопухолевой иммунотерапии с использованием СЭ2-специфических монокло-нальных антител (анти-СЭ2-мАт). Так, анти-СЭ2-мАт показали высокую эффективность при клинических испытаниях в лечении нейробла-стомы [6]. Основными механизмами действия ан-ти-СЭ2-мАт считаются антителозависимая кле-точноопосредованная цитотоксичность и ком-
Жизнеспособность клеток, % от контроля
0 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 Концентрация антител, мкг/мл
Рис. 1. Зависимость жизнеспособности клеток от концентрации анти-ОВ2-мАт в МТТ-тесте. Клетки EL-4 (5 тыс. кл./лунка) инкубировали с анти-ОВ2-мАт в течение 72 ч в 96-луночном планшете в ПС, содержащей 10% FBS. Каждая точка выполнена в трех повторах.
племент-зависимая цитотоксичность [7]. В то же время, в ряде работ была показана прямая цито-токсическая активность анти-ОЭ2-мАт. Так, на различных ОЭ2-позитивных опухолевых клетках, таких как нейробластома [8], мелкоклеточный рак легкого [9] и лимфома [10], показано, что анти-ОЭ2-антитела индуцируют клеточную гибель без привлечения иммунных механизмов. Также на сингенной мышиной модели перевиваемой опухоли EL-4 показаны противоопухолевые эффекты Fab-фрагментов анти-ОЭ2-мАт [11], что говорит о возможности реализации in vivo гибели опухолевых клеток при непосредственном воздействии на онкоассоциированный маркер GD2, без участия системы комплемента и/или эффекторных клеток. В то же время, тип клеточной гибели, вызываемой анти-GD2-мАт, а также ее сигнальные пути, не ясны.
Каспазы — это семейство цистеиновых проте-аз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты. Каспазы являются центральным звеном протеолитиче-ской системы, обеспечивающей запуск и проведение клеточной гибели, как правило, проходящей по механизму апоптоза, а сигнальные пути с их участием характеризуются как классические [12]. Каспазы принимают участие как в инициации гибели клетки, так и в ее реализации, выражающейся в расщеплении различных клеточных субстратов и приводящей к характерным морфологическим и биохимическим изменениям в клетке.
В настоящее время описано 14 каспаз, которые в той или иной степени участвуют в процессах
клеточной гибели [13], но ключевыми и наиболее изученными каспазами, определяющими классические механизмы апоптоза, являются каспазы-8, -9 и -3. Наиболее значимой инициаторной каспа-зой, приводящей к запуску рецепторопосредо-ванного пути апоптоза, является каспаза-8. Ми-тохондриальный путь апоптоза обычно опосредован активностью инициаторной каспазы-9. В обоих случаях ключевой эффекторной каспазой, приводящей к расщеплению клеточного субстрата, служит каспаза-3 [13]. Поскольку роль каспаз при развитии гибели клеток, обработанных антителами к ганглиозидам, не ясна, представлялось важным изучить роль инициаторных и эф-фекторных каспаз в клеточной гибели, индуцированной анти-0Э2-мАт 1402а, в клетках мышиной лимфомы БЬ-4, гиперэкспрессирую-щей ганглиозид 0Э2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее мы показали, что анти-0Э2-мАт способны индуцировать сильные цитотоксические эффекты в клетках мышиной лимфомы БЬ-4. Клетки данной линии являются удобной моделью для изучения прямого воздействия анти-0Э2-мАт, поскольку для них характерна высокая и равномерная экспрессия ганглиозида 0Э2 [10].
На первом этапе работы мы выбрали оптимальное анти-0Э2-мАт для проведения последующих экспериментов. Для этого были проведены сравнительные тесты цитотоксической активности анти-0Э2-моноклональных антител: 1402а и МЕ361. По результатам МТТ-теста получены графики зависимости жизнеспособности клеток БЬ-4 от концентрации антител 1402а и МЕ361 (рис. 1). Как следует из рис. 1, оба антитела вызывают дозо-зависимое снижение жизнеспособности клеток БЬ-4, но антитела 1402а имеют более выраженную цитотоксичность по сравнению с МЕ361. Снижение уровня жизнеспособности клеток при инкубации с максимальной использованной концентрацией (10 мкг/мл) анти-0Э2-мАт 1402а и МЕ361 составляет 80 и 60% соответственно.
Другим методом для сравнения цитотоксиче-ских эффектов анти-0Э2-мАт был выбран Р1-тест [14]. Мы исследовали временные зависимости изменения количества клеток с фрагментиро-ванной ДНК при действии антител на опухолевые клетки. Для этого клетки БЬ-4 инкубировали с антителами 1402а и МЕ361 (5 мкг/мл) в течение 24, 48 и 72 ч. Как следует из диаграммы, представленной на рис. 2, процент гиподиплоидных клеток с течением времени возрастает. Через трое суток после инкубации клеток БЬ-4 с мАт 1402а уровень их гибели составляет 67 ± 6%, а для МЕ361 — 30 ± 7%.
Таким образом, двумя методами было показано, что анти-0Э2-мАт 1402а и МБ361 индуциру-
% клеток с фрагментированной ДНК 80 г
60
40
20
| Контроль 1МЕ361 11402а
I
I
Т
Контроль 1402а
Стауроспорин
Относительный уровень экспрессии гена (10 2) 10
8
6
4
2
0
24
48
72
еа8р 3
еа8р 8
еа8р 9
Рис. 2. Временная зависимость клеточной гибели в Р1-тесте. Клетки БЬ-4 инкубировали с антителами 1402а (5мкг/мл) и МБ361 (5мкг/мл) в течение 24, 48 и 72 ч.
Рис. 3. Сравнение уровня экспрессии генов каспаз-3, -8, -9 в интактных клетках и в клетках, индуцированных антителами 1402а (5мкг/мл) и стауроспорином (50 нМ) в течение 12 ч. Эффективность ПЦР — 85%.
0
ют клеточную гибель, но эффективность их действия различается — антитела 1402а проявляют более высокую цитотоксическую активность и являются предпочтительными эффекторами при исследовании механизмов изучаемого процесса. Причины различий эффективности действия антител 1402а и МБ361 требуют дальнейшего исследования; возможно, они объясняются разной эффективностью связывания с ганглиозидом 0Э2 [15].
В следующей серии экспериментов с использованием метода ПЦР в реальном времени показано влияние выбранных анти-0Э2-мАт 1402а на уровень экспрессии генов прокаспаз-8, -9, -3 при индукции этим мАт гибели клеток линии БЬ-4. В качестве внутреннего контроля использован мышиный ген фермента гликолиза (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, 0АЭРИ). Положительным контролем индукции клеточной гибели выбран стауроспорин — алкалоид, являющийся ингибитором протеинкиназ и запускающий кас-пазозависимый путь апоптоза [16]. В предварительных экспериментах (регистрация Р1-мето-дом) нами была подобрана оптимальная концентрация стауроспорина (50 нМ) таким образом, чтобы уровни клеточной гибели, индуцирова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.