ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 2, с. 280-282
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.816:591.181:577.175.822
УЧАСТИЕ МУСКАРИНОВЫХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ИНТЕНСИВНОСТИ НЕКВАНТОВОГО ОСВОБОЖДЕНИЯ АЦЕТИЛХОЛИНА ИЗ ДВИГАТЕЛЬНЫХ НЕРВНЫХ ОКОНЧАНИЙ КРЫСЫ
© 2007 г. А. И. Маломуж, М. Р. Мухтаров, член-корреспондент РАН Е. Е. Никольский
Поступило 18.12.2006 г.
Возможность участия мускариновых холино-рецепторов в регуляции секреции ацетилхолина из двигательных нервных окончаний млекопитающих обсуждается достаточно давно, однако практически все имеющиеся на сегодняшний день данные, касаются модуляции процесса квантового выделения медиатора [1, 2]. При этом вопрос о влиянии активации мускариновых холинорецеп-торов на альтернативный вид секреции ацетилхолина - его неквантовое освобождение до последнего момента оставался не доказанным, несмотря на то, что имеются экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу такого способа ауторегуляции [3]. Поскольку медиатор, выделяемый неквантовым образом, участвует в нейро-трофическом контроле морфофункциональных свойств скелетных мышечных волокон [4, 5, 6], то исследование механизмов регуляции неквантовой секреции ацетилхолина представляется весьма актуальным. Целью данной работы явилось изучение возможности участия мускариновых хо-линорецепторов в модуляции интенсивности неквантового выделения ацетилхолина.
Эксперименты проводили на диафрагмальном нервно-мышечном препарате лабораторных крыс линии Вистар. Мышцу, выделенную из декапити-рованных под эфирным наркозом животных, фиксировали в ванночке из органического стекла объемом 1.5 см3, через которую протекал предварительно аэрированный раствор Рингера-Кребса стандартного состава [см. 7]. Измерение мембранного потенциала покоя (МПП) мышечных волокон производили с помощью внутриклеточных микроэлектродов, заполненных раствором KCl (2.5 моль/л) и имеющих сопротивление 5-10 МОм.
Интенсивность неквантовой секреции оценивали по величине Н-эффекта - степени гиперполяризации постсинаптической мембраны после блокирования холинорецепторов концевой пластинки d-тубокурарином в условиях необратимого ингибирования ацетилхолинэстеразы армином [8]. Для этого фрагмент диафрагмы инкубировали 30 мин в растворе Рингера-Кребса с армином (10 мкмоль/л), затем ингибитор "отмывали", после чего измеряли МПП в синаптической зоне 25 поверхностно расположенных мышечных волокон. Далее, в ванночку добавляли d-тубокурарин (10 мкмоль/л) и через 5 мин вновь измеряли МПП в 25 мышечных волокнах. Затем значения МПП, зарегистрированные до и после блокады холинорецепторов, усредняли, и по их разнице определяли величину Н-эффекта. Для статистической обработки данных использовали параметрический /■-критерий Стьюдента.
Величина Н-эффекта в контрольных мышцах составила 5.3 ± 0.2 мВ (п = 200, рис. 1, рис. 2). Добавление агониста мускариновых холинорецепторов оксотреморина приводило к концентраци-оннозависимому снижению Н-эффекта (рис. 1). Угнетающее Н-эффект влияние оксотреморина проявлялось, начиная с концентрации 1 нмоль/л, а максимальный угнетающий эффект достигался при концентрации миметика в 100 нмоль/л. В дальнейших экспериментах оксотреморин применяли в концентрации 50 нмоль/л, что приводило к снижению Н-эффекта на 68% (рис. 1). Следовательно, активация мускариновых холинорецепторов приводит к снижению интенсивности неквантовой секреции ацетилхолина. Литературные данные свидетельствуют, что в модуляции нервно-мышечной передачи могут принимать участие как Мг, так и М2-холинорецепторы [1, 2]. Использование селективного антагониста Мгхолинорецепто-ров пирензепина в концентрации 1 мкмоль/л полностью устранило угнетающее Н-эффект действие оксотреморина (рис. 2). Этот факт позволяет утверждать, что в холинергическом механизме регуляции неквантового освобождения медиатора
Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук Казанский государственный университет
УЧАСТИЕ МУСКАРИНОВЫХ ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ
281
Н-эффект, мВ 5 4 3 2 1
о Контроль • Оксотреморин
Контроль Оксо
Оксо + Пирен Пирен
Оксо + 0 Ca2+ 0 Ca2+
Оксо + L-Намэ L-Намэ
0 25 50 75 100
Концентрация оксотреморина, нМ
Рис. 1. Концентрационная зависимость величины H-эф-фекта при действии оксотреморина (0.1-100 нмоль/л). Каждая точка - среднее значение H-эффекта ± стандартная ошибка измерения (75-200 мышечных волокон 3-8 животных). Звездочка - p < 0.05 по сравнению с контролем.
задействованы именно Мгхолинорецепторы. Поскольку в ряде работ показано пространственное или функциональное сопряжение мускариновых рецепторов с кальциевыми каналами [2, 9], то логично было предположить, что и эффект оксотреморина связан с модуляцией кальциевой проницаемости и, таким образом, должен зависеть от содержания Са2+ во внешней среде. Действительно, в отсутствие ионов кальция в омывающем растворе величина Н-эффекта не изменялась при добавлении оксотреморина (рис. 2). Эти данные согласуются с представлением о том, что одним из ключевых моментов для реализации эффекта оксотреморина является вход ионов кальция из внеклеточного пространства, опосредованный Са2+-каналами, сопряженными с мускариновыми М1-холинорецепторами.
Ранее нами было показано, что интенсивность неквантовой секреции ацетилхолина может снижаться под действием молекул оксида азота (N0), синтезируемых кальцийзависимым ферментом N0-синтаза [7, 10]. В связи с этим было сделано предположение о возможном участии N0-синтазы в реализации эффекта оксотреморина на интенсивность неквантовой секреции ацетилхолина.
Конкурентный ингибитор N0-синтазы - К-нит-ро-Х-аргинин метиловый эфир (100 мкмоль/л) приводил к существенному возрастанию Н-эффекта, на фоне которого угнетающее действие оксотреморина полностью отсутствовало (рис. 2). Следовательно, опосредованный мускариновыми М1-холиноре-цепторами эффект оксотреморина на неквантовое освобождение ацетилхолина из двигательных нерв-
4 6 8 Н-эффект, мВ
Рис. 2. Влияние оксотреморина (Оксо; 50 нмоль/л) на величину Н-эффекта в контроле и в присутствии бло-катора мускариновых М^холинорецепторов пи-рензепина (Пирен; 1 мкмоль/л), ингибитора КО-син-тазы К-нитро-Х-аргинин метилового эфира (Х-Намэ; 100 мкмоль/л), а также в бескальциевом растворе (0 Са2+). Каждый столбец отражает среднее значение (вписано внутри столбца) ± стандартная ошибка измерения (75 - 225 мышечных волокон 3-9 животных). Звездочка -р < 0.05 по сравнению с контролем.
ных окончаний крысы реализуется через усиление Са2+-зависимой активности КО-синтазы.
Подводя итог изложенному выше, можно заключить, что в нервно-мышечном синапсе млекопитающих имеет место холинергический механизм регуляции неквантового освобождения медиатора, реализуемый посредством активации М1-холинорецепторов с последующим кальций-зависимым синтезом молекул N0. Несмотря на то, что выявленный нами механизм ауторегуля-ции выделения медиатора из нервного окончания предполагает локализацию мускариновых рецепторов в области пресинапса, тем не менее однозначно это утверждать на данном этапе мы не можем. К настоящему времени накоплено достаточно данных, демонстрирующих локализацию мускариновых холинорецепторов как на мембране перисинап-тических шванновских клеток [11], так и на мембране скелетных мышечных волокон [12]. Более того, известно, что основная часть КО-синтазы концевой пластинки сосредоточена именно в мышечном волокне [13] и, по-видимому, в шваннов-ской клетке [14]. Следовательно, вполне можно предполагать, что эффект мускариновых агони-стов связан с активацией М1-холинорецепторов на мембране мышечного волокна и/или на мембране шванновской клетки и усилением в них синтеза N0, молекулы которого способны ретроградно пересекать синаптическую щель и, таким образом, реализовывать свой эффект в нервном
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 414 < 2 2007
282
МАЛОМУЖ и др.
окончании. Эта гипотеза находит все больше экспериментальных подтверждений [7, 10].
Работа поддержана грантами Фонда содействия отечественной науки, РФФИ (05-04-49723) и Президента РФ "Ведущая научная школа" (№ 112.0/001/481).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Oliveira L., Timoteo M.A., Correia-de-Sa P. // Europ. J. Neurosci. 2002. V. 15. P. 1728-173б.
2. Santafe M.M., Lanuza M.A., Garcia N., Tomas J. // Europ. J. Neurosci. 200б. V. 23. P. 2048-205б.
3. Edwards C, Dolezal V., Tycek S. et al. // Puerto Rico Health Sci J. 19SS. V. 7. P. 71-74.
4. Sun Y.-a., Poo M.-m. // J. Neurosci. 19S5. V. 5. P. б34-б42.
5. Vyskocil F., Vrbova G. // Europ. J. Neurosci. 1993. V. 5. P. 1б77-1б83.
6. Nikolsky E.E., Zemkova H, Voronin V.A., Vyskocil F. // J. Physiol. 1994. V. 477. P. 497-502.
7. Malomouzh A.I, Mukhtarov M.R., Nikolsky E.E. et al. // J. Neurochemistry. 2003. V. 85. P. 206-213.
8. Malomouzh A.I., Nikolsky E.E., Lieberman E.M. et al. // J. Neurochemistry. 2005. V. 94. P. 257-267.
9. Bolton T.B, Kitamura K. // Brit. J. Pharmacol. 1983. V. 78. P. 405-415.
10. Mukhtarov M.R., Urazaev A.Kh, Nikolsky E.E, Vysko-Cil F. // Europ. J. Neurosci. 2000. V. 12. P. 980-986.
11. Rochon D, Rousse I, Robitaille R. // J. Neurosci. 2001. V. 21. P. 3819-3829.
12. Reyes R, Jaimovich E. // Arch. Biochem. and Biophysics. 1996. V. 331. P. 41-47.
13. Stamler J.S, Meissner G. // Physiol. Rev. 2001. V. 81. P. 209-237.
14. Pereira E C, Neto H.S, Marques M.J. // J. Anat. 2001. V. 198. P. 663-671.
ДОКЛАДЫ AKAДEMИИ НАУК том 414 < 2 2007
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.