БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 1, с. 36 - 46
УДК 577.112.853
УЧАСТИЕ Р-ГЛИКОПРОТЕИНА В ЭВОЛЮЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОЛЕЙКОЗА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИМАТИНИБА*
© 2008 г. Т.П. Стромская1**, Е.Ю. Рыбалкина1, С.С. Круглов2, Т.Н. Заботина1, Е.Б. Мечетнер3, А.Г. Туркина2, А.А. Ставровская1
1 НИИ канцерогенеза, ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478 Москва, Каширское ш., 24; электронная почта: stromsktat@mail.ru
2 Гематологический научный центр РАМН, 125167Москва, Новозыбковский пр., 4; электронная почта: tur@blood.ru
3 University of California at Irvine, Irvine Hall, Irvine 92697, USA; E-mail: emechetner@cox.net
Поступила в редакцию 30.05.07 После доработки 14.08.07
Иматиниб мезилат (иматиниб) — препарат нового поколения, успешно применяемый в последнее время для лечения злокачественных новообразований, в первую очередь для терапии хронического миелолейкоза (ХМЛ). Иматиниб блокирует активность химерной киназы BCR-ABL, образование которой лежит в основе возникновения ХМЛ. В данной работе выяснялась роль белка множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) опухолевых клеток Р-гликопротеина (Pgp) в эволюции ХМЛ при лечении иматинибом. Показано, что культивируемые клетки ХМЛ (линия K562/Í-S9), гиперэкспрессирующие активный Pgp, не обладают устойчивостью к воздействию иматиниба, несмотря на то, что препарат является субстратом Pgp. В результате обследования больных в фазе акселерации ХМЛ установлено, что изменение числа Pgp-положи-тельных клеток (Pgp+) при лечении иматинибом носит индивидуальный характер. Однако у большинства пациентов к 6—12 месяцам лечения наблюдается значительное возрастание числа клеток с фенотипом Pgp+. Высокое число Pgp-позитивных клеток сохраняется в течение длительного времени (минимальный период наблюдения 4,5 года) и коррелирует с активным выбросом родамина 123 (Rh123). Такая корреляция не обнаружена в группе резистентных к иматинибу больных, обследованных через 35—60 месяцев после начала лечения: клетки всех резистентных больных независимо от экспрессии Pgp выбрасывали Rh123. Показано, что клетки больных кроме Pgp экспрессировали несколько других транспортных белков семейства АВС. Сопоставлены характер выброса Rh123 клетками больных ХМЛ после 6—24 месяцев лечения и ответ пациентов на терапию. Обнаружены достоверные различия в выживаемости пациентов в зависимости от наличия или отсутствия выброса Rh123. Очевидно, при лечении иматинибом происходит отбор стволовых лей-козных клеток, характеризующихся экспрессией Pgp и других транспортеров семейства АВС.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Р-гликопротеин, хронический миелолейкоз, иматиниб, ингибитор тирозинкиназы BCR-ABL.
Иматиниб (иматиниб мезилат, 8Т1 571, О1ееуео) в последние годы успешно применяется для лечения злокачественных новообразова-
Принятые сокращения: ХМЛ — хронический миелолейкоз, ФА — фаза акселерации, Pgp — Р-гликопротеин, Rh123 — родамин 123, ЦО — цитогенетический ответ, ПЦО — полный цитогенетический ответ, МЛУ — множественная лекарственная устойчивость, АТ — антитела, ОАС — оценка антительного сдвига, FBS — fetal bovin serum.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 07-164, 11.11.2007.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ний, в первую очередь для терапии хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) [1, 2]. Это — мо-лекулярно-направленный препарат. В основе ХМЛ лежит реципрокная хромосомная транслокация 1 (9; 22), которая возникает в результате соматической мутации в стволовой кроветворной клетке и цитологически выражается в образовании укороченной хромосомы 22 (филадельфийская, или РИ-хромосома). В результате этой транслокации образуется химерный ген ВСЯ-АВЬ, чаще кодирующий белок р210вск-Ав^ реже — химерные белки с МГ 190 или 230 кДа (в зависимости от места разрыва в гене ВСЯ) с повышен-
ной тирозинкиназной активностью [3]. Имати-ниб блокирует активность киназы BCR-ABL, что вызывает гибель клеток с фенотипом BCR-ABL+. Более чем у 80% больных в хронической фазе ХМЛ в ответ на воздействие иматиниба наблюдается исчезновение клеток, несущих Ph-хромосому (полный цитогенетический ответ (ПЦО)) [4]. Этот эффект у большинства больных стабилен при продолжении лечения. Однако у некоторых больных может возникнуть устойчивость к иматинибу, особенно у больных в фазе акселерации (ФА) и в бластном кризе ХМЛ. Одной из возможных причин резистентности к иматинибу является повышение активности белков, принадлежащих к суперсемейству АВС (ATP-binding cassette) [5—7]. Белки семейства АВС связывают АТР и используют ее энергию для перемещения различных молекул через мембраны клетки. Белки этого семейства (включая те, которые вовлечены в лекарственную устойчивость опухолей) ответственны за выполнение важных физиологических функций в клетке [7, 8]. Повышенная экспрессия и активность Р-гликопротеина (Pgp или ABCB1) были первым обнаруженным механизмом, определяющим множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) опухолей [9]. МЛУ — Это система защиты клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку (таксаны, антра-циклины, винкаалкалоиды, подофиллотоксины и камптотецины и др.) [10]. В культивируемых клетках, характеризующихся Pgp-опосредован-ной МЛУ, обнаружена гиперэкспрессия одновременно нескольких АВС-транспортеров [11].
В последние годы большое внимание уделяется определению роли Pgp в резистентности к иматинибу. Были получены данные, свидетельствующие о том, что активный Pgp может вызвать устойчивость клеток к действию иматиниба. Во-первых, обнаружено, что Pgp связывает иматиниб [12]. Во-вторых, сублинии культивируемых клеток ХМЛ (линия К562), характеризующиеся постепенным повышением экспрессии Pgp, демонстрировали постепенное снижение накопления внутриклеточного иматиниба [13]. В-третьих, было установлено, что ингибирова-ние Pgp снижает уровень устойчивости клеток к иматинибу [14, 15]. Трансфекция в культивируемые клетки ХМЛ (линия AR230) гена MDR1 обусловливает их устойчивость к иматинибу [16]. Однако имеются и противоречащие этим выводам результаты. Было найдено, что клетки К562, трансфицированные геном MDR1, не приобретали устойчивость к иматинибу [17, 18]. Повышенная экспрессия Pgp стволовыми кроветворными клетками мышей не защищала
клетки от действия иматиниба [18]. Авторы различающихся по выводам работ обсуждают возможные причины этих различий и не исключают того, что в основе некоторых данных могут лежать артефакты.
Цель работы — выяснить, действительно ли Pgp не всегда защищает клетки ХМЛ от иматиниба, и проследить эволюцию экспрессии и функциональной активности Pgp при лечении больных в ФА ХМЛ иматинибом, чтобы определить, как влияет иматиниб на размножение клонов клеток, экспрессирующих функционально активный Pgp in vivo.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культивирование клеток. Клетки линии К562 и их резистентную сублинию K562/i-S9 растили на среде RPMI 1640 с 10% FBS и гентамицином (50 мкг/мл). Для окраски антителами (АТ) клетки отмывали от культуральной среды, фиксировали и обрабатывали АТ по протоколу, рекомендуемому фирмой для окраски клеток крови.
Клинический материал. Больные в ФА ХМЛ проходили лечение иматинибом в Гематологическом научном центре РАН с февраля 2001 г. по август 2005 г. Критерии для определения ФА ХМЛ приведены в работе [19]. Исследование ка-риотипа было проведено до начала лечения больных. Все больные получали 600 мг иматиниба в сутки. Большинство пациентов до начала лечения иматинибом получали другие лекарственные средства, применяемые при ХМЛ (ин-терферон-а, гидроксимочевину, цитарабин), и проходили различные курсы химиотерапии.
Иммуноцитохимический анализ белков МЛУ. Лимфоцитарную фракцию клеток крови выделяли на 1%-ном желатине. Остатки эритроцитов растворяли с помощью лизирующего буфера («Becton Dickinson», США). Выделенные лимфоциты промывали раствором фосфатного буфера, рН 7,4. Моноклональные антитела, используемые в работе («CHEMICON», США): UIC-2 (anti-MDR1), МАВ 4126-anti-LRP, MAB 4146-anti-BCRP, MAB 4122-anti-MRP. Конъюгацию с антителами UIC-2 проводили на нефиксированных клетках. Для окраски АТ к белкам LRP, BCRP, MRP клетки фиксировали 20 мин в 4%-ном растворе параформальдегида в фосфатном буфере, а затем обрабатывали 20 мин 0,2%-ным раствором Triton X-100 на фосфатном буфере. Приготовленные таким образом клетки использовали для последующей конъюгации с антителами по методике, описанной ранее [11]. Интенсивность флуоресценции клеток анализировали на проточном цитофлуориметре (FACScan
«Becton Dickinson»). Анализ проводили по программе CellQuest.
UIC2-ОАС (UIC2-shift assay). Для выявления связывания антител с функциональным Pgp клетки до конъюгации с антителами инкубировали 15 мин с 50 мкМ винбластина или имати-ниба. Далее клетки обрабатывали АТ по стандартной методике.
Оценка функциональной активности Pgp. Такую активность определяли по методике, описанной ранее [20]. Флуоресценцию клеток, окрашенных Rh123, оценивали на проточном ци-тофлуориметре. Для оценки количества клеток с фенотипом Rh123+ использовали коэффициент MAF [21], который вычисляли исходя из формулы
MAF =
Mean (ing) — Mean (free) Mean (ing)
где MAF — MDR Activity Functional, Mean (free) — значение средней флуоресценции клеток без ингибитора, Mean (ing) — значение средней флуоресценции клеток с ингибитором. Фенотип клеток считался положительным (Rh123+) при MAF > 0,1.
Выделение РНК и ОТ-ПЦР. РНК из клеток К562 и K562/i-S9 выделяли с помощью TRI Reagent («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием случайных праймеров. Для выравнивания количества кДНК в образцах амплифицировали ген домашнего хозяйства ß-актин. Использованные прай-меры и условия амплификации были описаны ранее [11].
Определение чувствительности клеток К562 и K562/i-S9 с помощью МТТ-метода. Клетки рас-севали в 96-луночное плато (10 тыс. на лунку в 100 мкл среды). Вещества (иматиниб или вин-бластин) добавляли в концентрациях 0,01—5 мкМ. После 72
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.