ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 6, с. 872-877
УДК 581.1
УЧАСТИЕ РЕАКЦИЙ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ-ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ В РЕДОКС-КОНТРОЛЕ ТРАНСЛЯЦИИ В МИТОХОНДРИЯХ ЗЛАКОВ
© 2004 г. И. Ю. Субота, А. Ш. Арзиев, Ю. М. Константинов
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук, Иркутск Поступила в редакцию 12.04.2004 г.
Сравнительный анализ зависимости синтеза белка в системе изолированных митохондрий у представителей культурных (Zea mays) и дикорастущих (Elymus sibiricus) злаков от изменения редокс-ус-ловий, создаваемых такими агентами, как окислитель феррицианид калия и природный биотиол глутатион, показал, что добавление к митохондриям феррицианида или глутатиона в окисленной форме приводит к активации трансляции in organello, тогда как использование глутатиона в восстановленной форме вызывает торможение этого процесса. Установлено, что ингибиторы протеинки-наз и протеинфосфатаз значительно модифицируют эффекты редокс-агентов на активность синтеза белка в митохондриях злаков. Предполагается, что фосфорилирование белков в митохондриях может быть одним из механизмов, опосредующих связь между редокс-состоянием дыхательной цепи и активностью митохондриальной трансляции.
Zea mays - Elymus sibiricus - митохондрии - трансляция - редокс-регуляция - глутатион - фосфорилирование белков
Несмотря на огромное число проведенных в последние годы исследований митохондриальных и ядерных генов, кодирующих белки митохондрий, проблема координированной экспрессии этих генов в ответ на изменения условий внешней среды остается недостаточно изученной.
Одним из механизмов координации экспрессии генов в составе ядерного и митохондриального геномов может быть редокс-регуляция их активности, основанная на окислительно-восстановительных реакциях с участием регуляторных БИ-групп ряда ДНК-связывающих транскрипционных факторов [1-3].
Известно, что у животных экспрессия митохондриальных и ядерных генов, кодирующих ми-тохондриальные белки, вовлеченные в окислительное фосфорилирование, а также факторов регуляции, участвующих в этом процессе, коор-динированно регулируется в ответ на изменения
Сокращения: FerCN - феррицианид калия; GSH - восстановленный глутатион, GSSG - окисленный глутатион, PK -протеинкиназа, PP - протеинфосфатаза; SHAM - салицил-гидроксамовая кислота, Str - стауроспорин, TTFA - теноил-трифторацетон.
Адрес для корреспонденции: Субота Ирина Юрьевна. 664033 Иркутск, а/я 1243. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: +7 (3952) 51-07-54; электронная почта: subota@sifibr.irk.ru
редокс-условий в клетке [1]. Установлено также, что изменения редокс-условий оказывают выраженное влияние на матричную активность митохондриального генома растений в отношении синтеза РНК и ДНК in organello [4].
Ранее нами было обнаружено [5, 6], что ре-докс-состояние отдельных комплексов дыхательной цепи оказывает значительное влияние на активность митохондриальной трансляции. Механизм такого взаимодействия и уровень, на котором осуществляется подобный контроль, пока не ясны. Одним из механизмов, опосредующих это взаимодействие, может быть фосфорилирование митохондриальных белков. Так, обнаружено существование связи между степенью фосфо-рилирования белка с мол. м. 13 кД и активностью синтеза белка в изолированных митохондриях гороха [7]. В то же время TTFA, ингибитор дыхательного комплекса II, подавляет митохондри-альный синтез белка в такой же степени, как и фосфорилирование белка 13 кД [7].
В пользу участия фосфорилирования белков в редокс-контроле генетических функций митохондрий свидетельствуют и обнаруженные ранее изменения активности синтеза РНК и ДНК в изолированных митохондриях кукурузы в присутствии ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз [4]. Обнаружена высокая чувствительность синтеза РНК в изолированных митохондриях картофеля к ингибитору протеинфосфатаз РР1 и
РР2 окадаевой кислоте [8]. Такой ингибитор про-теинфосфатаз широкого спектра действия как а-нафтилфосфорная кислота уменьшал на 40% активность включения [3И]-УТФ в кислотонерас-творимую фракцию изолированных митохондрий картофеля [8]. В то же время необходимо отметить, что вопросы участия фосфорилирования митохондриальных белков в редокс-контроле трансляционной активности этих органелл до последнего времени остаются практически неизученными.
Целью настоящей работы было изучение возможного участия реакций фосфорилирования-де-фосфорилирования белков в редокс-контроле синтеза белка в митохондриях у представителей культурных (Zea mays) и дикорастущих видов (Elymus sibiricus) злаков.
МЕТОДИКА
В работе были использованы 4-дневные этиолированные проростки кукурузы (Zea mays L., гибрид ВИР 42МВ) и 10-дневные этиолированные проростки пырейника сибирского (Elymus sibiricus L.). Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования с последующей очисткой в градиенте плотности сахарозы [9]. Проростки (30 г) гомогенизировали в среде выделения (СВ), содержащей 0.25 М сахарозу, 18 мМ KH2PO4, 5 мМ ЭДТА-№2, 10 мМ КС1,
1 мМ MgC12, 10 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.1% БСА (рН 7.2) при температуре 0-4°С. Соотношение количества проростков и СВ составляло 1 : 4.
Полученный гомогенат фильтровали через капроновую ткань. Ядра и крупные клеточные фрагменты отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g (центрифуга К-24, "MLW", Германия).
Митохондрии осаждали при 15000 g в течение 5 мин. Осадок промывали в 10 мл среды промывания (СВ без 2-меркаптоэтанола, рН 7.2) и подвергали повторному центрифугированию при 15000 g в течение 5 мин.
После ресуспендирования в 5 мл среды промывания митохондрии подвергали очистке в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы (0.4, 0.8 и 1.2 М) центрифугированием в течение 30 мин при 5000 g (центрифуга К-23, "MLW"). Митохондрии переосаждали при 15000 g в течение 10 мин. Осадок митохондрий ресуспендировали в среде, используемой для синтеза белка (БС), имеющей следующий состав: 0.14 М сахароза, 60 мМ КС1, 15 мМ Трис-HCl, рН 7.2, 5 мМ KH2PO4, 6 мМ MgC12, 4 мМ Р-меркаптоэтанол, 10 мМ сукцинат натрия,
2 мМ ГТФ, 2 hM АТФ, 0.1 мМ каждой из 19 аминокислот (кроме меченой).
Получение митопластов осуществляли согласно работе [10]. Осадок митохондрий ресуспенди-
ровали в 2 мл среды, содержащей 0.3 М сахарозу, 50 мМ Трис-HCl, pH 7.9, 3 мМ ЭДТА-№2 и диги-тонин (5мг/мл). Затем суспензию инкубировали 5 мин при температуре 4°С. После инкубации смесь разбавляли 20 объемами той же среды. Фракцию митопластов осаждали центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин. Митоплас-ты ресуспендировали в среде БС.
Синтез белка в митохондриях кукурузы проводили при температуре 30°С, в митохондриях пырейника сибирского - при 25°С по методу, описанному в работе [11] с незначительными модификациями. Трансляционную активность митохондрий определяли по включению радиоактивно меченой аминокислоты в кислотонерастворимую мито-хондриальную фракцию. В работе использовался [14C]-лейцин с удельной радиоактивностью 1520 ТБк/моль, [3Н]-аланин и [358]-метионин ("Изотоп", Санкт-Петербург, Россия). Реакцию синтеза белка начинали добавлением митохондрий. Аликвоту очищенных митохондрий (100 мкл) инкубировали в среде БС (200 мкл) с 30 мкКи радиоактивно меченой аминокислоты. Реакцию синтеза белка проводили в течение 20-40 мин. Для измерения радиоактивности митохондриальных проб из инкубационной среды отбирали аликво-ты объемом 50 мкл, наносили на диски из хрома-тографической бумаги Whatman 3MM и фиксировали в охлажденном растворе 20% ТХУ не менее 20 мин. Затем диски дважды промывали холодной 5% ТХУ, многократно промывали этанолом до нейтральной рН, высушивали и помещали во флаконы с 2 мл сцинтилляционного раствора. Определение радиоактивности образцов проводили с помощью жидкостного счетчика Wallac-8100 ("LKB", Швеция). Для определения концентрации белка использовали метод Lowry с соавт. [12].
В работе использованы реактивы фирмы "Sigma" (США). Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Результаты экспериментов обрабатывали методами параметрической статистики. Для этого использовали пакеты программ: GRAPHPAD (версия 2.0; 1987; H.J. Motulsky) и Su-pe^afc 4 (версия 1.00).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Регистрацию кинетики синтеза белка проводили в течение первых 30-40 мин после выделения митохондрий. Оказалось, что для синтеза белка в изолированных митохондриях необходим сукцинат в качестве субстрата дыхания. При замене его на другие субстраты, такие как малат и пируват, синтеза белка не происходило. Хлорамфеникол, известный как ингибитор трансляции на 70S рибосомах, подавлял активность синтеза белка в изолированных митохондриях кукурузы (данные не приводятся). Это указывает на то, что в используемой нами системе происходит синтез
w ч
о &
н к о м н о
с« К
н
в
«
0 ч
1
о
«
и к о в 2 ч м PQ
160 140 120 100 80 60 40 20 0
120
*
п
** **
Контроль FerCN(5 мМ)
NaF(40 мМ) Str(200 мМ)
100
л ^
К ей
И м нл
св о ч ю ? 1-н
г-^ £
к в
3 0
u S
н ¡с к в
^ в
2 <N
К I
а -
PQ
80
60
40
20
5 10
Время, мин
15
Рис. 1. Влияние феррицианида калия и ингибиторов протеинкиназ и протеинфосфатаз на трансляционную активность митохондрий кукурузы. *Р < 0.05 по сравнению с контролем; **Р < 0.01 по сравнению с контролем.
именно митохондриальных полипептидов, так как цитоплазматические рибосомы нечувствительны к хлорамфениколу [13]. Обработка мито-хондриальной суспензии РнКазой А не оказывала заметного эффекта на белок-синтезируюшую активность, что говорит об интактности орга-нелл. Абсолютная потребность используемой нами системы синтеза белка к определенному дыхательному субстрату указывает на практически полное отсутствие бактериального загрязнения в митохондриальной суспензии [13].
Ранее, в экспериментах с использованием таких редокс-агентов как феррицианид калия и ди-тионит натрия, показано, что редокс-условия могут оказывать выраженное влияние на экспрессию митохондриального генома растений, как в отношении транскрипции, так и трансляции in organelle [4-6]. В присутствии феррицианида калия, используемого в качест
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.