МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 169-174
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.841.4.017.73+577.1123.38+164.16]
УЧАСТИЕ ВИТАМИНА В12 В БИОСИНТЕЗЕ ДНК У METHYLOBACTERIUM DICHLOROMETHANICUM, ЗАВИСИМОЕ ОТ ИНТЕНСИВНОСТИ АЭРАЦИИ
© 2004 г. И. В. Данилова*, Н. В. Доронина**, Ю. А. Троценко**, А. И. Нетрусов*, Е. П. Рыжкова (Иордан)*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра микробиологии **Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 20.12.02 г.
Впервые изучено влияние витамина В12 (кобаламина) на биосинтез ДНК у Methylobacterium dichlo-romethanicum. При росте на средах с метанолом или дихлорметаном бактерия образует примерно 10 мкг/г АСБ корриноидов, а на средах с этанолом или сукцинатом - на 30% меньше. Кофермент-В12 (аденозилкобаламин, AdoCbl) выступает как стимулятор биосинтеза ДНК в условиях ограниченной аэрации культуры; активность рибонуклеотидредуктазы (РНРазы) при этом зависит от AdoCbl. Бактерия обладает и альтернативной РНРазой, которая, по данным ингибиторного анализа, а также по характеру проявления активности in vitro, не зависит от AdoCbl. В условиях интенсивной аэрации экзогенный AdoCbl не влиял на биосинтез ДНК, а гидроксимочевина его подавляла. Следовательно, у M. dichloromethanicum биосинтез ДНК может происходить либо с участием кобаламина, либо без его участия благодаря функционированию альтернативных РНРаз. При достаточной аэрации в биосинтезе ДНК у M. dichloromethanicum существенна роль независимой от кобаламина РНРазы, активируемой, по-видимому, кислородом. При ограниченном доступе кислорода в обеспечении биосинтеза ДНК дезоксирибозильными предшественниками принимает участие AdoCbl-зависимый фермент.
Ключевые слова: Methylobacterium dichloromethanicum, рибонуклеотидредуктаза, витамин В12, аденозилкобаламин, биосинтез ДНК.
Коферментные формы кобаламина (витамина В12), метилкобаламин и аденозилкобаламин (АёоСЫ), участвуют в десятках биохимических реакций [1]. Особое место среди АёоСЫ-зависимых ферментов занимает рибонуклеотидредуктаза (РНРаза, КФ 1.17.4), ответственная за превращение четырех рибонуклеотидов в соответствующие дезоксирибонуклеотиды. Фермент катализирует первую специфическую и скоростьлимити-рущую стадию в анаболизме ДНК. У организмов, имеющих АёоСЫ-зависимую РНРазу, этот фермент является "мишенью" воздействия витамина В12 на интенсивность образования и содержание ДНК в клетке (копийность бактериальной хромосомы) [2].
В12-зависимая РНРаза наиболее широко распространена у прокариот. Однако у бактерий выявлено несколько разновидностей РНРаз, отличающихся природой кофермента, особенностями механизма свободнорадикального катализа и отношением к молекулярному кислороду [1-5]. Вместе с тем показана возможность одновременного присутствия РНРаз двух и более типов у одного организма [4, 6-9].
Ограниченно-факультативный метилотроф МвгНу1оЪасгвпит ЛсЫоготвгНатсит способен разлагать высокотоксичный растворитель дихлорме-тан, загрязняющий окружающую среду [10]. Однако метилотрофные трансформанты, экспрессиру-ющие структурный ген дихлорметандегалогеназы йстА, не только не способны расти на этом соединении, но у них наблюдается деструкция ДНК в результате алкилирующего действия интермеди-атов окисления дихлорметана. Предполагается, что у бактерий, использующих дихлорметан, в поддержании стабильности генома активное участие принимают ферменты синтеза и репарации ДНК [11]. Известны виды рода МвгНу1оЪасгвпит, которые являются активными продуцентами витамина В12 [12]. У МвгНу1оЪасгвпит вхЮщивт АМ1 найден кобаламинзависимый фермент, который участвует в изоцитратлиазо-отрицатель-ном варианте серинового цикла ассимиляции С1-соединений [13, 14]. Многие представители рода МвАу1оЪас1впит являются фитосимбионтами и способны расти в микроаэробных условиях [12], поэтому представлялось логичным предположение о наличии у М. йкЫототвЛатсит В12-зависи-мой РНРазы. Ранее было показано, что у пропио-
новокислых бактерий, имеющих AdoCbl-зависи-мую РНРазу, витамин В12 контролирует биосинтез ДНК [15, 16]. Представлялось важным выяснить, проявляются ли эти закономерности у метилотроф-ных бактерий, синтезирующих корриноиды.
В настоящей работе представлены данные о синтезе витамина В12 бактерией, вовлечении ко-баламина в процесс образования ДНК через AdoCbl-зависимую РНРазу (в условиях ограниченной аэрации), а также о возможности бактерии синтезировать ДНК без участия кобаламина (при высокой интенсивности аэрации).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Methylobacterium dichloromethanicum DM4 (ВКМ В-2191 = DSMZ 6343) [12] выращивали в течение 48 ч при 28°С в колбах объемом 750 мл с 200 мл среды, содержащей (г/л): KH2PO4 - 2.0; (NH4)2SO4 - 2.0; NaCl - 0.5; MgSO4 ■ 7H2O - 0.125; FeSO4 ■ 7H2O - 0.002 и метанол - 50 мМ; рН 7.3, при встряхивании на роторной качалке (300 об/мин). Для опытов по регистрации биосинтеза ДНК бактерии выращивали в колбах объемом 250 мл со 100 мл среды того же состава. Высокую и низкую степени аэрации культуры обеспечивали, варьируя скорости перемешивания от 300 до 125 об/мин соответственно. Культивирование на дихлормета-не проводили, как описано ранее [10]. Рост культуры измеряли гравиметрически по приросту абсолютно сухой биомассы (АСБ, принятый биотехнологический термин, обозначающий постоянный вес высушенной при 105°С биомассы клеток). Общее содержание корриноидов определяли микробиологическим методом с тест-культурой Escherichia coli 113-3 [16].
При определении РНРазной активности отмытые от среды клетки ресуспендировали при 0°С в 0.05 М К-фосфатном буфере (рН 7.0) с 1 мМ ди-тиотрейтолом (ДТТ, "Reanal", Венгрия), 1 мМ №4ЭДТА в соотношении вес сырой биомассы : : объем = 1 : 2, и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (Россия) в режиме: 22 кГц, 40 мкА, 10 раз по 30 с и охлаждением по 2 мин (0°С). Полученный экстракт освобождали от неразрушенных клеток и их фрагментов центрифугированием (30000 g, 30 мин, 6°С) и диализовали против того же буфера. Состав реакционной смеси: 0.05 М К-фосфатный буфер, 0.54.0 мМ АДФ ("Reanal", Венгрия), 25 мМ ДТТ, экстракт клеток, 4-6 мг/мл (по белку). Концентрации других компонентов варьировали (в зависимости от условий опытов). Объем реакционной смеси 0.2 мл, время инкубации 15 мин, температура 37°С. Концентрации продукта реакции измеряли по дезоксирибозе с дифениламиновым реактивом [17] и/или радиохроматографическим методом с использованием ВЭЖХ на колонке Altex Ultrasphere ODS C18, 4.6 х 250 мм, диаметр частиц
5 мкм, используя 50 мМ K2HPO4 (pH 4.5) с 10%-ным (по объему) метанолом в качестве подвижной фазы [4].
Биосинтез ДНК в клетках оценивали по включению [8-14С]аденина (В/О Изотоп, Россия) в ще-лочестабильную кислотонерастворимую фракцию [15]. Удельная радиоактивность меченого аденина 10.2 х 109 Бк/г. Меченый (74 х 103 Бк/мл) и немеченый (5 мкг/мл) аденин добавляли в суспензию клеток (1.5-2.0 мг АСБ/мл) экспоненциальной фазы роста, отмытых и сконцентрированных в 0.05 М К-фосфатном буфере с добавлением 0.125% (по объему) метанола. Инкубацию проводили при 30°С. Белок определяли по методу Лоури.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Необходимым условием синтеза корриноидов (соединений группы витамина В12) является наличие в среде кобальта, входящего в состав корриноидов. По нашим данным M. dichloromethanicum образует примерно 10 мкг/г АСБ корриноидов на среде с метанолом или дихлорметаном, не обогащенной специально ионами кобальта. При увеличении концентрации кобальта в среде с метанолом до 1 мг/л возрастало содержание суммарных корриноидов в клетках (рис. 1а). В диапазоне исследованных концентраций кобальт существенно не влиял на рост M. dichloromethanicum. Обнаружили, что при метилотрофном росте культура синтезирует на 30% больше корриноидов, чем на средах с этанолом и сукцинатом (рис. 16). Содержание корриноидов при культивировании мети-лотрофа на средах с дихлорметаном и метанолом было примерно одинаковым. Как видно из представленных данных, для M. dichloromethanicum характерен низкий уровень образования корриноидов, типичный для многих бактерий, способных к синтезу витамина В12. Однако известны прокариоты, образующие в норме на один-два порядка больше корриноидов. Среди них - Propionibacterium freudenreichii, Streptomyces olivaceus, Metha-nosarcina barkeri, цианобактерии. Для этих организмов показано стимулирующее действие ионов кобальта на образование внутриклеточных корриноидов [1], а для некоторых из них - на рост культур.
Итак, установили, что M. dichloromethanicum, подобно другим представителям рода Methylobacterium, синтезирует корриноиды. У многих прокариот витамин В12 (кобаламин) участвует в процессе образования ДНК на уровне формирования дезоксирибозильных предшественников при участии РНРазы. Широкое распространение AdoCbl-зависимой РНРазы (класса II) у прокариот определяется ее инертностью по отношению к кислороду. Образование культурой витамина В 12, или ауксотрофия по нему, является необходимым, но недостаточным условием наличия у организма
(а)
14
12
/г
г/ к 10
£
ы 8
ид
о н 6
и
р 4
р о
о
2
0
0 0.25
0.50 0.75 1 CoCl2 ■ 6H2O, мг/л
4 £
I-Q
О <
- 2
14
12 /г
S3 10
£
I 8
и § 6
н &
& 4 о ^
2 0
(б)
4л
Р
О <
Рис. 1. Рост и образование корриноидов в клетках М. йкМогошеЛатсиш. 1 - Максимальное количество АСБ, г/л; 2 -содержание корриноидов в клетках в период активного роста, мкг/г (АСБ). а - на средах с 50 мМ метанолом и различной концентрацией СоС12 • 6Н20. б - на средах с 1 мг/л СоС12 • 6Н20 и различными источниками углерода (50 мМ): метанол (А), этанол (Б); сукцинат-№ (В).
В12-зависимой РНРазы. Для облигатных аэробов, независимо от их способности образовывать корри-ноиды, возможно функционирование либо РНРазы класса I или IV (активируются молекулярным кислородом и содержат легко диссоциирующую белковую субъединицу, несущую негеминовое Fe или Mn), либо РНРазы класса II (содержит AdoCbl и инертна по отношению к молекулярному кислороду) [1, 3, 5]. Одним из доказательств наличия AdoCbl-зависимой РНРазы является усиление
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.