БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 5, с. 598 - 606
УДК 577.123
УЧАСТКИ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С МАТРИКСОМ (СКАФФОЛДОМ), И ВНУТРЕННИЕ ИЗГИБЫ ДНК
Обзор
© 2006 г. А. Фиорини, Ф.С. Гувейя, М.А. Фернандес*
Departamento de Biología Celular e Genetica, Universidade Estadual de Maringa, Av. Colombo 5790, Maringa, Parana 87020-900, Brazil; fax: (55)4432-614-893, E-mail: mafernandez@uem.br, aparecidafernandez@gmail.com
Поступила в редакцию 22.07.05 После доработки 30.11.05
Согласно последним данным не выявлено консенсусной нуклеотидной последовательности, характерной для всех участков ДНК, ассоциированных с ядерным матриксом (скаффолдом) (S/MARs). Отсутствие характерного для всех S/MARs мотива в сочетании с данными о некоторых S/MARs, не ассоциированных с определенными последовательностями ДНК, свидетельствует о роли структурных элементов, таких как изгибы оси ДНК, в организации хроматина и в эффективности его связывания с белками. Как и участки ДНК, содержащие внутренние изгибы, S/MARs локализованы близко к промоторам, точкам начала репликации и сайтам расщепления. Структура хроматина этих регуляторных областей важна для организации хромосом и аккуратной регуляции ядерных процессов. Рассматривается биологическое значение совместной локализации S/MARs и участков ДНК, содержащих изгибы цепи.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ядерный матрикс, ядерный скелет (скаффолд), S/MARs, ДНК с внутренними изгибами, предсказание in silico.
УЧАСТКИ ДНК,
АССОЦИИРОВАННЫЕ С ЯДЕРНЫМ МАТРИКСОМ/СКАФФОЛДОМ (S/MARs)
^руктура ядерного матрикса. Эукариотичес-кий хроматин организован в большие домены или петли, разделенные скелетом (scaffold) или интерфазными ядерными структурами (ядерный матрикс). Из этих двух терминов «ядерный матрикс» употребляется наиболее часто [1]. Ядерный матрикс является структурной рамкой, образованной сетью белков, состоящей из комплекса ядерные поры—ядерная ламина, остатков ядрышка и внутренней фибриллярно-глобулярной сети [2, 3]. Ядерная ламина — белковая сеть, прилегающая к внутренней стороне ядерной мембраны [1, 4], — может играть важную роль в функциональной организации интерфазного хроматина.
Особенности S/MARs. Специфические последовательности ДНК, находящиеся в основаниях петель, называют участками, ассоциированными с матриксом (Matrix Attachment Regions [5] или Scaffold Attachment Regions — S/MARs) [6, 7]. В данном обзоре, согласно Bode
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
с соавт. [8], используются термины S/MARs или S/MAR-элемент. Длина петель ДНК, образующихся при прикреплении к ядерному матриксу, варьирует от 5 до 200 тыс. пар оснований (п.о.) в соответствии с расстояниями между соседними S/MARs [9]. Было установлено, что существуют два типа S/MARs: постоянные (конститутивные), содержащие регуляторные, нетранскри-бируемые участки ДНК, и временные (факультативные), содержащие транскрибируемые и реплицируемые участки ДНК [10, 11]. Наиболее часто S/MARs локализуются в некодирующих областях ДНК, предположительно содержащих регуляторные элементы и сайты связывания с топоизомеразой II [5, 12]. Топоизомераза II — компонент ядерного матрикса, выделяемого методом высокосолевой экстракции [13, 14]. Как сообщалось О.В. Яровой с соавт. [15], сайты, расположенные в местах скрепления петель, которые были картированы с помощью катализируемой топоизомеразой реакции внесения двух-цепочечных разрывов в ДНК в участках образования петель (topoisomerase II mediated DNA loop excision protocol), совпадают со слабыми S/MARs. Это свидетельствует о том, что такие участки — необходимые, но недостаточные элементы участка скрепления ДНК-петли.
Хотя никаких очевидных особенностей, характерных для всех S/MARs, не было найдено, известно, что для них характерно наличие АТ-богатых последовательностей, таких как (AT)n и ATATTT-мотивы, что необходимо для плавления ДНК при относительно мягких условиях [16]. Эти АТ-богатые районы преимущественно защищены от нуклеаз белками, взаимодействующими со S/MAR-последовательностями [14, 17].
Экспериментальное обнаружение S/MARs. S/MARs определяются как фрагменты ДНК, способные специфически связываться с изолированным ядерным матриксом, скелетной структурой, сохраняющей общую форму ядра после удаления ДНК и связанных с ней гисто-новых белков. Существует несколько методов определения S/MARs in vitro и in vivo [2, 5, 7, 15, 18]. В случае детектирования in vitro ядра обрабатывают ДНК-полимеразой I, гистоны и не-гистоновые белки экстрагируют с использованием 2 M NaCl. Затем ядерный матрикс инкубируют с фрагментами экзогенной ДНК из исследуемой области генома, содержащими концевую метку. Связавшиеся фрагменты ДНК отделяют методом центрифугирования, очищают и анализируют методом электрофореза в ПААГ с последующей радиоавтографией [5, 18].
При выделении in vivo последовательности ДНК разделяют на связанные и не связанные с матриксом фрагменты (рис. 1). В этом случае ядра экстрагируют с помощью дийодосалицила-та лития (LIS) и полученную ДНК подвергают рестрикции, используя комбинацию рестрик-таз. После центрифугирования фракции ДНК, связанные и не связанные с матриксом, определяют с помощью Саузерн-блоттинга или ПЦР [2, 7, 16, 19—21], с использованием специфических проб и последующим электрофоретическим анализом получившихся продуктов.
ДНК-Петли и S/MARs могут быть выявлены с помощью гибридизации in situ (FISH-гибри-дизации), позволяющей определить функциональные и структурные особенности этих районов [11, 22—24]. Недавно был предложен новый метод картирования S/MARs в больших сегментах генома [25], основанный на использовании технологии микроэрреев. В настоящее время этот метод позволяет заменить традиционные способы идентификации S/MARs благодаря простоте и доступности последовательностей различных геномов, содержащихся в биологических банках данных http//www.ncbi.nlm.nih.gov; www.ebi.ac.uk/embl/; http// www.ddbj.nig.ac.jp/
Взаимосвязь между S/MARs и ядерными процессами. С момента открытия хромосомных петель интенсивно обсуждался вопрос о связи между организацией ДНК внутри петель и рас-
пределением функциональных единиц генома. Многие ядерные функции, с которыми предположительно связаны S/MARs, имеют отношение к ядерному матриксу [8]. Предполагается, что ядерный матрикс участвует в организации хроматина, а также в репликации и экспрессии генов [1]. S/MARs участвуют в регуляции транскрипции в клетках растений и млекопитающих [26, 27]. Экспериментально подтверждено их наличие в нескольких генетических локусах, включая ген, кодирующий лизоцим курицы [28], ген р-интерферона человека [8], ген человеческого р-глобина [29], ген а-глобина курицы [10, 25, 30], р53 [31], кластер генов протамина человека [32] и АМРБ2-ампликон клеток китайского хомячка, в которых помимо определенных локусов четыре S/MARs были найдены в межгенных областях [33]. S/MARs могут влиять на доступность хроматина в правой от промото-
purified nuclei
extracted LIS
nuclear halo
restriction enzyme digestion
.^centrifugaron ;
r cl (
PCR
MAR
M L M L
Electro-
phoresis
A B
Рис. 1. Детектирование S/MARs in vivo. Электрофореграм-ма полученных продуктов. Экстрагированные с помощью LIS ядра подвергали рестрикции, использовав комбинацию рестриктаз, и центрифугированию. Супернатант, содержавший петли (L), и осадок, содержавший ассоциированную с матриксом фракцию (M), помещали в разные пробирки. Для изучения предсказанных S/MARs была проведена ПЦР с соответствующими праймерами. В случае А больше ассоциированных, чем неассоциированных с матриксом участков, в случае В больше неассоциирован-ных, чем ассоциированных участков
A
B
ра области и вследствие этого заметно усиливать транскрипцию соответствующих генов [34].
Гены могут быть локализованы в непосредственной близости от S/MAR-элементов (например, ген рДНКчеловека, ген DHFR (яичника китайского хомячка), ген c-myc человека и ген Н5 курицы) [35]. Все S/MARs, описанные Homberger [36], локализованы выше или ниже точки начала транскрипции генов Drosophila. Известно, что S/MARs локализованы вместе с энхансероподобными регуляторными элементами четырех генов Drosophila, описанных Gasser и Laemmli [2]. В клетках эукариот точка начала репликации ассоциирована с ядерным матриксом [21, 37-43]. Более 40% S/MARs из генома Drosophila, а также из геномов других организмов (например, S/MAR, локализованный в первом интроне гена HPRT и других локусах генома человека) действуют как ARS-элементы в клетках дрожжей [44-46]. Было показано, что участок ДНК тутового шелкопряда, ассоциированный с ядерным матриксом (rS/MAR), функционирует как активная область начала репликации хромосомы в клетках дрожжей [47]. Белки, связанные со S/MARs, непосредственно участвуют в регуляции транскрипции [48]. Так, например, белок SAFB1, связывающийся с участками ДНК, ассоциированными с ядерным матриксом, взаимодействуя с АТ-богатой последовательностью, принимает участие в связи между структурой хроматина, транскрипцией и процессингом мРНК, а также, возможно, в репрессии, индуцированной рецептором эстрогена (ERa)-трансактивации.
Показано, что сверхэкспрессия SAFB1 приводит к подавлению роста опухолевых клеток при раке молочной железы [49]. Большее число АТ-богатых участков, приводящее к уменьшению жесткости структуры ДНК, способствует ее ассоциации с ядерным матриксом (скаффолдом) [50]. В настоящее время S/MARs могут быть ассоциированы с серией не вполне определенных мотивов [51, 52]. Таким образом способность к ассоциации с матриксом, видимо, должна обусловливаться внешними эпигенетическими факторами.
Из литературных данных известно, что горячие точки рекомбинации хромосом, приводящей к хромосомным перестройкам, обычно разделены участками ДНК длиной 20-100 п.о. Длина этих участков коррелирует со средними размерами ДНК-петель. ДНК-Топоизомераза II — компонент ядерного матрикса. Она может способствовать неканонической рекомбинации in vitro [53]. Вследствие этого можно предположить, что незаконная рекомбинация ДНК происходит преимущественно в сайтах, ассоцииро-
ванных с ядерным матриксом [24]. В данной работе была выдвин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.