научная статья по теме УЧАСТВУЕТ ЛИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК (67 КД) ИЗ ЛИСТЬЕВ ЯЧМЕНЯ И ARABIDOPSIS THALIANA В ОТВЕТЕ ЛИСТЬЕВ НА ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛМОЧЕВИНЫ? Биология

Текст научной статьи на тему «УЧАСТВУЕТ ЛИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК (67 КД) ИЗ ЛИСТЬЕВ ЯЧМЕНЯ И ARABIDOPSIS THALIANA В ОТВЕТЕ ЛИСТЬЕВ НА ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛМОЧЕВИНЫ?»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 6, с. 878-886

== ОБЗОР =

УДК 581.1:577.352.3

УЧАСТВУЕТ ЛИ ЦИТОКИНИН-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК (67 кД)

ИЗ ЛИСТЬЕВ ЯЧМЕНЯ И Arabidopsis thaliana В ОТВЕТЕ ЛИСТЬЕВ НА ПРОИЗВОДНЫЕ ФЕНИЛМОЧЕВИНЫ?

© 2004 г. Н. Н. Каравайко, С. Ю. Селиванкина, Н. В. Кудрякова, Г. Г. Маслова, Э. Ä. Бурханова, Н. К. Зубкова, О. Н. Кулаева

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Поступила в редакцию 22.04.2004 г.

Из закончивших рост листьев первого яруса 8-10-дневных растений ячменя и из розеточных листьев 9-недельных растений Arabidopsis thaliana выделены цитокинин-связывающие белки (67-кД ЦСБ). Цитокинин-связывающая способность 67-кД ЦСБ показана по конкуренции транс-зеатина с анти-идиотипическими антителами (АТа-и) за связывание с 67-кД ЦСБ, иммобилизованным в условиях твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа. АТа-и получали против антител к транс-зеатину. 67-кД ЦСБ из А. thaliana и ячменя активировал в комплексе с транс-зеатином элонгацию транскрипции in vitro в системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу I из тех же листьев. Производное фенилмочевины с высокой цитокининовой активностью, К-фенил-К1-(2-хлор-4-пири-дил)-мочевина (4-PU-30), не вытесняло АТа-и из комплекса с 67-кД ЦСБ из ячменя и A. thaliana, что указывает на отсутствие его взаимодействия с ЦСБ. In vitro 4-PU-30 не активировала в присутствии 67-кД ЦСБ транскрипцию в системе, содержащей хроматин и связанную с ним РНК-полимеразу I из листьев A. thaliana или ячменя. Следовательно, 4-PU-30 в отличие от транс-зеатина не использовала 67-кД ЦСБ для активации транскрипции. Предынкубация листьев A. thaliana на растворе 4-PU-30 в течение 1 ч увеличивала синтез РНК in vitro в транскрипционной системе, содержащей хроматин и РНК-полимеразу I, выделенные из предобработанных 4-PU-30 листьев. Следовательно, листья воспринимали 4-PU-30 с помощью другого рецептора. На это указывает и задержка старения листьев с помощью 4-PU-30. Другое высокоактивное производное фенилмочевины - тидиазурон, также активировало синтез в листьях рРНК и задерживало их старение.

Arabidopsis thaliana - Hordeum vulgare - цитокинины - транс-зеатин - 4-PU-30 - тидиазурон - ци-токинин-связывающий белок - рецептор - транскрипция

Одна из загадок в изучении цитокининов состоит в том, что гормональной активностью обладают не только производные аденина, к которым относится природный цитокинин транс-зеа-тин и родственные ему соединения, но и совершенно другой тип веществ - производные фенилмочевины. Это было обнаружено сначала для дифенилмочевины, а затем для большого числа ее синтетических аналогов, среди которых было исследовано более 150 соединений [1, 2]. Некоторые производные фенилмочевины превосхо-

Сокращения: АТа-и - антиидиотипические антитела; АТз -антитела против транс-зеатина; АТз-Сефароза - сефароза с иммобилизованными АТз; ЗР-Сефароза - сефароза с иммобилизованным зеатинрибозидом; ИФА - иммуноферментный анализ; ЦСБ - цитокинин-связывающий белок; 4-PU-30 - N-фенил-К1-(2-хлор-4-пиридил)-мочевина. Адрес для корреспонденции: Кулаева Ольга Николаевна. 127276 Москва, ул. Ботаническая, 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07 (095) 977-80-18; электронная почта: okulaeva@mail.ru

дят по активности в ряде биотестов цитокинины пуринового ряда. Особенно высокой активностью отличается К-фенил-К1-(2-хлор-4-пиридил)-мочевина (4-PU-30) [2]. Она обладает широким спектром цитокининовой активности: стимулирует рост каллуса паренхимной ткани сердцевины стебля табака, задерживает распад хлорофилла в отрезках листьев некоторых растений, индуцирует рост латеральных почек, снимая апикальное доминирование [2]. 4-PU-30 была активнее БАП в стимуляции роста культуры Dunaliella salina, усиливала синтез бетацианина в семядолях Amaran-thus caudatus, активировала рост семядолей редиса и огурца [3], увеличивала накопление биомассы и хлорофилла у эксплантов гвоздики [4], способствовала лучшему развитию внутренней мембранной системы хлоропластов у культивируемых in vitro растений Gypsophila [5] и активировала рост боковых почек у культивируемых in vitro растений Rosa hybrida [6].

Высокая цитокининовая активность была обнаружена также у другого представителя фенил-

мочевины - тидиазурона [К-фенил-К1-(1,2,3-ти-диазол-5-ил)-мочевина], который используется в качестве дефолианта хлопчатника [7], но в низких концентрациях вызывает цитокининовые эффекты [8-12].

Тидиазурон активировал рост биомассы суспензионной культуры клеток табака, задерживал старение отрезков листьев ячменя, активировал прорастание семян салата, но резко ингибировал рост проростков огурца и АтаЫйор818 [8]. Тидиазурон стимулировал рост высечек из этиолированных проростков фасоли; проявлял большую активность, чем БАП, в индукции нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя [9]; активировал рост семядолей у интактных проростков тыквы в большей степени, чем БАП, но ингибировал рост главного корня и образование боковых корней в концентрациях (5 х 10-9 и 5 х 10-8 М), в которых БАП активировал эти процессы [11].

Перечисленное убедительно показывает широкий спектр цитокининовой активности 4-РИ-30 и тидиазурона. Однако их действие по ряду параметров отличается от действия цитокининов пу-ринового ряда. Встает вопрос о причинах цитокининовой активности представителей двух различных в химическом отношении типов соединений. Высказывалось предположение, что производные фенилмочевины проявляют цитокининовую активность не прямо, а влияя на уровень в растении эндогенных цитокининов пуринового типа. Подобная возможность подтверждается тем, что дифенилмочевина индуцировала у отдельных штаммов каллусов Рказео1ш ¡ыиаШз цитокинин-независимость [13], что позволяет ожидать в них синтез эндогенных цитокининов. Кроме того, дифенилмочевина, 4-РИ-30 и тидиазурон подавляют активность цитокинин-оксидазы [14], что может привести к повышению содержания в растении эндогенных цитокининов пуринового типа. Третья возможность состоит в том, что производные фенилмочевины способны индуцировать в клетках цитокининовый сигнал, используя рецепторы эндогенных цитокининов. Такую возможность допускает гипотетическая модель цитокининово-го рецептора, предложенная Ягужинским и Рахманиновой [15]. В последнее время получены экспериментальные подтверждения возможности действия производных фенилмочевины через мембранный рецептор цитокининов [16].

Вместе с тем, в настоящее время установлено, что цитокинины пуринового типа способны проникать внутрь клетки, используя переносчики аденина [17]. Этому соответствует обнаружение цитокининов в цитоплазме, ядрах и хлоропластах растительных клеток [18, 19]. Присутствие цитокининов внутри растительной клетки ставит вопрос об их внутриклеточных рецепторах. Это не противоречит открытию мембранных рецепто-

ров. Например, стероидные гормоны животных передают свои сигналы через ядерные и мембранные рецепторы [20]. В связи со сказанным интерес представляют внутриклеточные цитоки-нин-связывающие белки (ЦСБ). 67-кД ЦСБ с высоким сродством к природному цитокинину транс-зеатину был выделен из цитозоля листьев ячменя [21-23]. Белок в комплексе с транс-зеати-ном активировал синтез РНК в системе элонгации транскрипции, содержащей хроматин и связанную с ним РнК-полимеразу I из листьев ячменя. В последующем было установлено присутствие ЦСБ в ядрах и хлоропластах листьев ячменя и их участие в регуляции синтеза РНК соответственно в ядерных и хлоропластных транскрипционных системах [22, 24, 25]. Это делает вероятным существование наряду с мембранными ядерных и хлоропластных рецепторов цитокининов [22, 24]. 67-кД ЦСБ, регулирующий в комплексе с транс-зеати-ном транскрипцию, был выделен также из листьев Arabidopsis thaliana [26]. Родственный ему 70-кД ЦСБ изолирован из этиолированных проростков кукурузы [27].

Представление о множественности систем рецепции и трансдукции гормональных сигналов находит в последнее время все больше подтверждений [20, 28-30]. Это делает существенным изучение взаимодействия сигнальных молекул с рецепторами разного уровня действия.

В нашу задачу входило выяснить, взаимодействуют ли цитокинины, производные фенилмочевины, с внутриклеточным белком (67-кД ЦСБ), выполняющим роль рецептора транс-зеатина, участвующего в регуляции транскрипции. С этой целью мы изучили, связывает ли 67-кД ЦСБ из листьев ячменя и A. thaliana синтетическое высокоактивное производное фенилмочевины, 4-PU-30, и образует ли с ним комплекс, участвующий в регуляции транскрипции. Важно также было убедиться, проявляется ли влияние производных фенилмочевины, 4-PU-30 и тидиазурона, при их прямом воздействии на листья A. thaliana и ячменя.

МЕТОДИКА

Растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. экотипа Columbia выращивали в климатической камере в почве в константных условиях: фотопериод 16 ч, интенсивность света 50 Вт/м2, дневная температура 22-23°С, ночная температура 18°С и относительная влажность воздуха 70%. Розеточ-ные листья 3- и 4-го ярусов срезали с растений в возрасте 9 нед. и использовали для биотестирования цитокининовой активности по задержке старения в темноте, для изоляции ЦСБ и хроматина. Растения ячменя (Hordeum vulgare L., сорт Viner) выращивали в почве в тех же факторостатных условиях, что и растения A. thaliana. Закончившие рост листья первого яруса срезали с растений в

возрасте 8-10 сут и использовали в биотесте на цитокинины по задержке старения и для выделения ЦСБ и хроматина.

ЦСБ из цитозоля листьев A. thaliana и ячменя выделяли с помощью разработанной ранее методики [21]. Все процедуры проводили при 2-4°С. Листья гомогенизировали в 3-4 объемах буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 7.7, 100 мМ MgCl2, 250 мМ сахарозу и 5 мМ 2-меркаптоэтанол ("Sigma", США), и центрифугировали при 160000 g в течение 2 ч. Белки очищали от низкомолекулярных соединений с помощью колонки Sephadex G-50 ("Pharmacia", Швеция), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ Трис-HCl, рН 7.7, 10 мМ MgCl2, 0.5 M NaCl и 5 мМ 2-меркаптоэтанол. Затем ЦСБ очищали с помощью гидрофобной хроматографии на фенил-Сефарозе CL-4B ("

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком