МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК [ 577.323.23+577.323.24] ::577.323.4
УЧЕТ ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОГО СТРУКТУРИРОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ПРИ ТЕР МОДИНАМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ ФОР МИР ОВАНИЯ ДНК-КОМПЛЕКСОВ
© 2012 г. А.А. Ломзов, Д.В. Пышный
Институт xимической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 8 E-mail: 1от10У@тЬосН.тс.гы Поступила в p едакцию 18.05.11 г.
И сследовано влияние внутpимолекуляpныx cтpуктуp олигонуклеотидов на теpмодинамичеcкие и кинетические xа pактеpиcтики фоpмиpования межмолекуляpныx ДНК/ДНК-комплексов. Раз-pаботаны модели, позволяющие доводить учет одноцепочечного cтpуктуpиpования олигонуклеотидов пpи опpеделении количественные теpмодинамичеcкиx и кинетичеcкиx характеристик обpазования дуплекcов. Показано, что наличие шпилечные cтpуктуp у компонентов комплекса может cущеcтвенно повлиять на опpеделяемые величины теpмодинамичеcкиx вкладов от фоpмиpования отдельныx cтpуктуpныx элементов двойной стлали ДНК. Пpедложен «концентрационный» метод учета внутpимолекуляpного cтpуктуpиpования олигонуклеотидов пpи определении теpмодинамичеcкиx паpаметpов обpазования бимолекуляpныx дуплексов. Методом оcтановленной cтpуи показано, что внутpимолекуляpное cтpуктуpиpование оказывает влияние на наблюдаемые константы cкоpоcтей пpямой и обpатной pеакции. Уcтановлено увеличение влияния втоpичныx cтpуктуp пpи cнижении темпеpатуpы иccледованныx обpазцов. Анализ экcпеpиментальныx данные c иcпользованием pазpаботанныx нами моделей позволят определять «истинные» кинетические константы перехода спираль-клубок. Наблюдаемые величины констант скоростей реакций могут отличаться от истинных до двух порядков.
Ключевые слова: кинетика, термодинамика, ДНК-комплексы, вторичные структуры, шпильки.
Возможно сть прогностического расчета термостабильности комплексов нуклеиновых кислот определило в течение последнего десятилетия значительный успех применения олигонуклеотидов в различных областях как фундаментальных исследований, так и прикладных разработок. Детально изучены комплексообра -зующие свойства нативных олигонуклеотидов. Разработана модель «ближайших со седей», позволяющая проводить пр едвар ительный расчет термодинамических параметров (изменения энтальпии и энтропии) фор мирования комплемен-тар ных комплексов нуклеиновых кислот: ДНК/ДНК (например, [1-3]), РНК/РНК (например, [4]) и химерных ДНК/РНК [2]. К роме того, показана применимость модели ближайших со -седей для количественного описания эффектов, связанных с наличием в нативной двойной спирали ДНК различных возмущений структуры: некомплементарных пар оснований, однонук-леотидных нависаний [3] и модифицированных звеньев, например, «скованных» нуклеиновых кислот (ЬКЛ), [5], дезоксирибоинозина [6] или выпетливаний нуклеотидной [7] и ненуклеотид-ной природы [8].
Точность прогностического расчета стабильности комплексов нуклеиновых кислот, как и надежность экспериментального определения величин термодинамических инкрементов образования отдельных фрагментов структуры комплексов, получаемых в рамках приближения ближайших соседей, являются модель-зависимыми характеристиками. Качество пар аметри-зации системы взаимодействующих олигонук-леотидов определяется надежностью выполнения приближения «все или ничего», или модели «двух состояний», предполагающей, что олиго-меры находятся в равновесии исключительно между двумя со стояниями: неструктурированной одноцепочечной и двухцепочечной формами. Общепр инятыми экспериментальными критериями возможности применения данного приближения является выполнение следующих критериев: 1) экспериментальные кривые оптического плавления и теоретические, рассчитанные в приближении модели двух состояний, должны совпадать [9,10]; 2) термодинамические пара -метры, полученные методом оптимизации кривых плавления на разных длинах волн, должны совпадать [11]; 3) должна наблюдаться линейная
зависимость обратной температуры от логарифма концентрации (с коэффициентом корреляции Я2 более 0,95) [12]; 4) термодинамические пар аметры, полученные методом, оптимизации и концентрационным методом должны отличаться не более чем на 10% [9].
Для решения большинства задач молеку-ляр ной биологии и биофизики используют относительно протяженные олигонуклеотиды, со -держащие от 10 до 30 нуклеотидных звеньев. Однако такие олигомеры часто содержат в своей структуре частично комплементарные участки, что позволяет им формировать внутримолекулярные комплексы - «шпильки». Было показано, что шпилечные структуры могут значительно замедлять скоро сть формирования комплексов нуклеиновых кислот и, следовательно, снижать их наблюдаемую термостабильность [13-15]. Предложены механизмы, описывающие взаимодействие шпилечных структур при формировании межмолекулярного комплекса, основываясь на которых определяют количественные хар актеристики кинетики формирования различных комплексов [16]. Для нахождения количественных характеристик перехода из одно цепочечного состояния в двухце-почечное обычно используют упрощенное описание, например, рассматривают такой процесс, как реакцию псевдопервого порядка [17]. К роме того, для нахождения величин констант скоро -стей реакций ищут аналитическое решение кинетических уравнений и затем минимизуют разницу между экспериментальными и расчетными кривыми [18]. Полученные таким образом результаты в полной мере не позволяют проанализировать протекающие процессы, а выявляют лишь некоторые наблюдаемые закономерности. Нахождение строгого решения системы кинетических уравнений позволит провести детальный анализ влияния вторичных структур на эффективность образования межмолекулярных комплексов.
Полная схема, описывающая формирование дуплекса при наличии в исследуемой системе одноцепочечных структурированных форм, выглядит следующим образом (например, [19]):
А + В
^ ЛВ,
Л+
- ^ НЛ,
X. А
НВ+
В ^ НВ,
X.. В
где А, В, АВ, НА(В) - олигонуклеотиды, формируемый ими комплекс и шпилечные структуры соответственно; к+ и к— (г = НЛ, НВ, ЛВ) - константы скор остей ассоциации и диссоциации соответствующих комплексов. Константы равновесия образования комплекса связаны с константами скоро стей прямой и обратной р еакции соотношением: К1 = к+/к—.
П ри достижении термодинамического р ав-новесия в модельной системе (1)-(3), при экви-молярном соотношении взаимодействующих компонент ([А]0 = [Всвязь доли двухцепо-чечного состояния (а = [АВ]/[А]0) с полной концентрацией олигонуклеотидов в растворе (Ст = [А ]0+[В ]0) и термодинамическими пара -метрами формирования комплексов (изменение энтальпии (ДН0), энтропии (Д50) и свободной энергии Гиббса, рассчитанной при температуре Т (ДОТ,), г = НА, НВ, ЛВ)), может быть представлена в следующем виде:
К
ЛВ
2а
1
(1 + Кнл)(1 + Кнв) (1 - а)2 Ст'
К = е "
ДО0. Тг
' ят ,
ДОТг = ДН 0 ■
Т ДБ 0.
(4.1)
(4.2)
(4.3)
(1)
(2)
(3),
Используя модель ближайших соседей для расчета термической стабильности комплексов и привлекая данные о термической стабильно -сти вторичных структур, можно вычислить наблюдаемую термостабильность межмолекулярных комплексов путем численного решения уравнения (4.1) [20].
Для учета вторичных структур при определении термодинамических параметров образования комплексов олигонуклеотидов из экспериментов по термической денатурации в литератур е используют несколько подходов [21-25]. В некоторых случаях применяют упрощение, в рамках которого наличием вторичных структур пренебрегают. В таком приближении экспериментальные кривые термической денатурации комплексов с высокой точностью описываются теоретическими кривыми, рассчитанными в рамках модели двух состояний [18,19]. Однако данный подход не всегда является корректным, так как одноцепочечное структурирование может в значительной мере влиять на комплек-сообразующие свойства [9].
Другим используемым подходом является рассмотрение процессов, связанных одноцепо-чечным структур ир ованием, в качестве факторов, определяющих изменение базовой линии
ЛВ
оптического поглощения одноцепочечного со -стояния пр и описании кривых термической денатурации, зарегистрированных фотометрически [20]. Данный подход, с нашей точки зрения, непр авомерен в связи с тем, что рассматривает только оптические характеристики перехода, но не учитывает равновесного перераспределения форм между двух- и одноцепочечными (структур ир ованным и неструктурированным) состояниями. В общем случае, наблюдаемая величина энергии обр азования комплекса зависит от доли одноцепочечного структурированного состояния. Продемонстрировать это можно на примере двух крайних случаев, описываемых приближением двух состояний: 1) шпилечных структур с низкой термической стабильностью; 2) внутримолекулярных комплексов значительно более стабильных, чем бимолекулярный комплекс. Первый случай сводится к отсутствию вторичных структур олигомеров. Во втором случае рассматривают переход из двухцепочеч-ного в одноцепочечное структурированное со -стояние. Для вычисления энергии перехода из неструктурированного одноцепочечного со -стояния олигомеров в бимолекулярный комплекс необходимо выделить термодинамический вклад от внутримолекулярного структурирования его компонент [10]. Однако это не берется во внимание при учете вторичных структур только в оптических характеристиках перехода спираль-клубок.
Существуют подходы для определения термодинамических параметров формирования комплексов, компоненты которых образуют шпилечные структур ы из зависимости их флуоресценции от температуры в приближении избытка целевой последовательности ДНК, с которой они взаимодействуют [21]. Также предложен метод определения термодинамических пар аметров формир ования самокомплементарного комплекса, компонент которого формирует шпилечную структуру из экспериментов по термической денатурации с регистрацией сигнала ЯМР [22]. Однако данные экспер имен-тальные методики не являются широко используемыми для систематических исследований термодинамических свойств нуклеиновых кислот, а рассмотренные в данных работах случаи являются частными.
Одним из наиболее ра спр остраненных способов определения термодинамич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.