»
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том. 21, № И, с. 885 - 889
УДК 577.112.853.083:543.422.25
УДОБНЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ОЛИГОСАХАРИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ N-ГЛИКОПРОТЕИНОВ ИЗ ФАЗЕОЛИНА - ГЛАВНОГО РЕЗЕРВНОГО БЕЛКА ФАСОЛИ
© 1995 г. Н. П. Арбатский*, JI. М. Лихошерстов, И. В. Калинина, А. О. Желтова, В, Н. Шибаев
Институт органической химии им. И.Д. Зелинского РАИ, 117913, Москва,Ленинский просп., 47
Поступила в редакцию 11.01.95 г.
Разработан препаративный метод выделения N-сйязанных олигосахаридных фрагментов из фазеолина - главного резервного белка фасоли Phaseolus vulgaris. В результате расщепления фазеолина действием LiBH4 или NaBH4-BaCl2 в водном Ви'ОН, последующего восстановления NaBHj и ВЭЖХ получены индивидуальные о л и го са х а р и дал ь д и тол ы Man5 _9GlcNAc,GlcNAc-ol и Man3(Xyl)GlcNAc,GlcNAc-ol. Главные углеводные цепи фазеолина - Man<,GlcNAc2, Man7G!cNAc2 и Man3{Xyl)GlcNAc2 - получены также в невосстановленном виде с помощью последовательной ани-онообменной хроматографии и ВЭЖХ. Олигосахариды идентифицированы по поведению при хроматографии и данным моносахаридкого состава, их структура подтверждена спектрами 'Н-ЯМР.
Ключевые слова: фазеолин, фасоль Phaseolus vulgaris олигосахариды, выделение.
В связи с неослабевающим интересом к изучению структуры и функции углеводных цепей гли-копротеинов возникает потребность в индивидуальных недеградированных олигосахаридных фрагментах гликопротеинов. Они могут быть использованы в качестве стандартных соединений для х р о м а то гр а фи че ско й идентификации углеводных цепей гликопротеинов, а также (после модификации) для получения неогликоконъюга-тов путем "пришивки" их к природным белкам или синтетическим полимерам. Для целей идентификации чаще всего используют восстановленные (в том числе ?Н-мече-ные) олигосахариды [1] или их флуоресцентные 2-аминопиридиновые производные [2], а для получения неогликоконъюгатов необходимо иметь олигосахариды со свободным восстанавливающим концом.
Наиболее целесообразно получать олигосахариды в препаративном масштабе, выделяя их после избирательной деградации химическими методами относительно доступных природных гликопротеинов. В качестве таковых могут служить гликопротеины семян бобовых, в частности фазеолин -- главный резервный белок фасоли. Фазеолин - - это семейство гомологичных белков (двух или более) с М 45 - 50 «Да, содержащих одну или две Ляп-связанные углеводные цепи [3]. Углеводные фрагменты фазеолина представляют собой обычные для белков растений и животных олиго-
* Автор для переписки.
маннозидные цепи, а также характерные только для гликопротеинов растений олигосахариды, содержащие ксилозу [3 - 5]. Таким образом, фазеолин можно рассматривать как очень удобный источник для получения олигосахаридов указанных выше типов.
В настоящей работе описан препаративный метод выделения из фазеолина семян белой фасоли Phaseolus vulgaris его недеградированных углеводных фрагментов в виде восстановленных и восстанавли ва ющих олигосахаридов.
Фазеолин выделяли по модифицированному нами методу [6], включающему экстракцию фасолевой муки раствором NaCl, центрифугирование и диализ супернатанта против воды. Выбранные оптимальные условия (4°С, продолжительность экстракции 40 мин) соответствовали достаточно полному извлечению фазеолина при минимальной экстракции других углеводсодер-жащих соединений. При диализе экстракта нерастворимый в деионизованной воде фазеолин выпадает в осадок, который отделяли центрифугированием. После повторного растворения в солевом растворе и осаждения при диализе полученный с выходом -4% фазеолин при электрофорезе в ПААГ в присутствии SDS давал четыре полосы в районе 42 - 50 кДа, что согласуется с литературными данными [3].
Олигосахаридные фрагменты фазеолина отщепляли с помощью разработанных нами ранее методов - обработкой LiBH4 или NaBH4-BaCl2 в
886
АРБАТСКИЙ и др.
"'210
(а)
М9-о1 I М7-о1
МЗХ-о] Мб-ol М5-о1
(б)
мин
Рис. 1. БЭЖХ суммарной смеси олигосахаридаль-дитолов, полученных из различных партий фасоли (а, б) на колонке (1 х 25 см) Ultrasphere CI8 в воде (0,4 мл/мин). Шифры олигосахаридов соответствуют приведенным на схеме.
водном Ви'ОН [7, 8]. Последний метод применялся при деградации большого количества исходного гликопротеина (1 - 10 г) как более экономичный и безопасный. После обессоливания реакционной смеси и разделения олигосахаридов и гликопеп-тидов на катионите получали смесь восстанав-
Xylpl
Мала l-2Manal-2Mana Ц (D,) (С) (4) \ J,
Manal-2Manalx 3
(D2) (А)
Manal-2Manal/ (D.,) (В)
■ Mantxl
¿Manp l-4GlcNAcp 1-4R
/ (3) (2) (1)
Шифр олигосахарида R Отсутствует остаток
(VI 9-о 1 GlcNAc-ol Xyl
М9 GlcNAc Xyl
М8-о1 GlcNAc-ol Xyl, D2
М7-о1 GlcNAc-ol Xyl, D2,
М7 GlcNAc Xyl, D2, D4
М6-о1 GlcNAc-ol Xyl, D~2, D3,D,
М5-о1 GlcNAc-ol Xyl, D2, D3, D|, С
МЗХ-ol GlcNAc-ol D2, D3,D|,C, А, В
Схема.
ливающих олигосахаридов, содержащую небольшое количество (5 - 10%) олигосахаридальдито-лов. Часть материала восстанавливали NaBH4 и смесь олигосахаридальдитолов разделяли ВЭЖХ на колонке Ultrasphere С18 в воде (рис. 1а). Для хроматографической идентификации использовали олигоманнозидные фрагменты, полученные ранее из гемагглютинина вируса гриппа [9], а количество моносахаридных остатков рассчитывали из результатов анализа кислотного гидролиза-та выделенных олигосахаридов. Как и ожидалось исходя из литературных данных [3], главными компонентами смеси оказались олигосахариды, содержащие в расчете на восстановленное хито-биозное звено 9 и 7 остатков Man (M9-ol и М7-о1), а также олигосахарид, содержащий 3 остатка Man и 1 остаток Ху1 (МЗХ-ol). Минорные компоненты соответствовали олигоманнозидным цепям с 8, 6 и 5 остатками Man (M8-ol, Мб-ol и М5-о1, рис. 1а, схема).
Следует отметить, что количественные соотношения олигосахаридов значительно изменялись в зависимости от партии фасоли, хотя главными во всех случаях оставались олигосахариды M9-ol, М7-о1 и МЗХ-ol (рис. 16).
Структура полученных олигосахаридов (см. схему) следовала из данных 'Н-ЯМР-спектров (таблица). В спектре каждого олигосахарида имелись два сигнала протонов NHAc-групп остатков GlcNAc и GlcNAc-ol (при 2.05 - 2.07 м. д.) и соответствующее число сигналов аномерных протонов остатков GlcNAc и Man, а для олигосахарида МЗХ-ol наблюдался характерный сигнал HI остатка (З-Xyl [3, 10]. Значения химических сдвигов Н1 остатков Man и GlcNAc для олигосахаридаль-дитола М9-о1 довольно хорошо совпадают с данными работы [10] для соответствующего олигосахарида. Небольшие отклонения объясняются, по-видимому, различием в температурном режиме при снятии спектров (70 и 27°С) и различиями в структуре восстанавливающего конца углеводной цепи. Учитывая тот факт, что во всех без исключения случаях выделения из гликопротеинов животных и растений восстанавливающего олигосахарида с 9 остатками Man он имел структуру, приведенную на схеме, структура полученного нами олигосахаридальдитола М9-о1 не вызывает сомнения.
Несколько сложнее установить по спектру структуру олигосахаридов, содержащих от 5 до 8 остатков Man, так как для каждого из них возможны изомерные структуры, различающиеся положением концевых остатков Man. Однако решение этой задачи облегчается тем, что, во-первых, химические сдвиги сигналов HI остатков маннозы А, В и С (см. таблицу) в М9-о1 достоверно различаются (-5.4, 5.1 и 5.3 м. д. соответственно), а, во-вторых, при отсутствии какого-либо из
Химические сдвиги аномерных протонов в 'Н-ММР-спектрах олигосахаридальдитолов (8, м. д.)*
' к * с. о 03 г-X ^ DrC-4. DrA^ ,/3-2-1 DrB" DrC-4. А^ ,/3-2-1 DrB" D.-C-4-А> В 7^3-2-1 C-4-v А^ В /3-2-1 4^ А. /3-2-1 /4 В Ху1 /3-2-1 4'
S у о О ж ,s M9-oI М8-о1 М7-о1 М6-о1 М5-о1 МЗХ-ol
.й I эксп. лит. эксп. лит. эксп. лит. эксп. лит. эксп. лит. эксп. лит.***
2 4.665 4.610 4.659 4.621 4.665 4.621 4.669 4.621 4.664 4.606 4.648 4.634
3 4.783 4.77 4.775 4.78 4.781 4.78' 4.785 4.78 4.788 4.781 4.853 4.883
4 5.330 5.334 5.331 5.336 5.337 5.336 5.351 5.345 5.124 5.099 5.123 5.122
4' 4.883 4.869 4.877 4.869 4.884 4.869 4.888 4.869 4.880 4.872 4.904 4.913
А 5.384 5.404 5.1 10 5.090 5.118 5.090 5.121 5.090 5.113 5.093 - -
В 5.127 5.143 5.125 5.145 4.922 4.908 4.925 4.908 4.918 4.908 - -
С 5.297 5.308 5.289 5.304 5.292 5.304 5.072 5.052 - - - -
D, 5.072 5.049 5.058 5.044 5.062 5.044 - - - - - -
D, 5.081 5.061 - - - - - - - - - -
D-, 5.063 5.042 5.058 5.044 - - - - • - - -
Ху1 - - - - - - - - - ■ ■ 4.462 4.449
* Для сравнения приведены литературные данные (лит.) для соответствующих восстанавливающих олигосахаридов, полученных в составе гликопептидов [10]; спектры сняты при 27°С. ** См. схему.
*** Приведены данные работы [4] для аналогичного олигосахаридальдитола; спектр снят при 27°С.
концевых остатков Man (Г),, D, или D,) сигнал HI остатка Man (А, В или С), к которому он был присоединен, сдвигается на 0.2 - 0.3 м. д. в сильное поле [10]. Руководствуясь этим правилом, легко установить, какому из изомеров соответствует выделенный нами олигосахарид. Так, в области аномерных протонов в спектре олигосахарнда М8-о1 по сравнению с М9-о1 имеются только два сигнала при -5.06 м. д.. характерных для HI остатков D. отсутствует сигнал замещенного остатка А (~5.4 м. д.) и появляется сигнал при ~5.1 м. д. Из этого однозначно следует, что олигосахарид М8-о1 отличается от М9-о1 отсутствием остатка маннозы D2.
Аналогичным путем установлена структура и других олигосахаридов (см. схему). Таким образом, кроме идентичных выделенным ранее в виде гликопептидов [3] углеводных фрагментов фазе-олина (М9, М7 и МЗХ) нами получены также М8, Мб и М5. Как главные, так и минорные олигоса-хариды имеют структуру, типичную для многих N-гликопротеинов растений и животных [5,10-12].
С точки зрения практического использования больший интерес представляют восстанавливающие олигосахариды, открытый гликозидный центр которых позволяет проводить различные модификации. Однако выделение индивидуальных восстанавливающих олигосахаридов - гораздо более сложная задача, поскольку олигосахариды каждого типа при описанном методе деградац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.